Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-13T12:59:41Z
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2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Introdução: Diversos estudos discutem a segurança do uso de nanopartículas já que estas são capazes de promover alterações na expressão gênica, padrão epigenético, homeostase do ferro e estresse oxidativo em ensaios in vitro. Uma gama de estudos aponta diferentes comportamentos celulares em resposta à exposição a nanopartículas, mas ainda não existe um consenso sobre os reais benefícios e riscos que estes nanomateriais podem apresentar em um sistema biológico complexo. Portanto, torna-se necessário estudar estes riscos a fim de contribuir com o desenvolvimento de nanopartículas mais adequadas para aplicações biológicas. Objetivo: Avaliar e caracterizar os possíveis efeitos citotóxicos e epigenéticos em células de carcinoma de glândula submandibular humana (HSG) submetidas a exposição de nanopartículas de maghemita funcionalizadas com cobertura de citrato (NPs). Analisar possíveis alterações na expressão gênica mediante a quantificação do número de transcritos para determinados genes alvo comprometidos com a regulação epigenética e estresse oxidativo. Materiais e métodos: As NPM-citrato foram sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe (II) e Fe (III) e adição direta de ácido cítrico. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados por detecção da lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de MTT. A morfologia celular foi analisada por coloração panótica InstaProv em microscópio de luz. A detecção de ferro intracelular foi realizada pelo ensaio do Azul da Prússia. As quantificações de metilação global de DNA e de acetilação das histonas H3 e H4 foram realizados por ensaio colorimétrico. A expressão dos genes FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 foi realizada por qRT-PCR. Para análise da produção de espécies reativas de oxigênio foi utilizado protocolo de H2DCFA. Resultados: As NPM-citrato nas concentrações testadas de 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL não apresentaram efeito citotóxico pela metodologia empregadas. Contudo, foram observadas alterações na morfologia celular, como vacuolização citoplasmática nas células expostas a nanopartículas por 24h e 48h, presença de ferro intracelular mesmo após a retirada do tratamento, intensa produção de espécies reativas de oxigênio dose e tempo dependentes, diminuição no perfil global de metilação de DNA e acetilação das histonas H3 e H4: a acetilação da H3 diminui para 38% e 62% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Para a H4 a hipoacetilação foi mais acentuada, diminuindo de 82% para 4% e 10% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Diferenças entre o acúmulo de transcritos dos genes estudados também foram observadas: transcritos referentes aos genes de COX-2, FERRL, e FERRH encontraram-se aumentados, enquanto que DNMT3a sofreu uma diminuição no número de transcritos. Conclusão: Concluímos que as nanopartículas de maghemita recobertas com citrato são capazes de induzir vacuolização citoplasmática, acúmulo de ROS, diminuição do padrão de metilação global e de acetilação de H3 e H4, alteração do acúmulo dos transcritos COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a e HDAC1 sem comprometer a viabilidade das células HSG. Esse é o primeiro relato sobre os efeitos genéticos e epigenéticos das NPM-citrato sobre células HSG. / Introduction: A plethora of studies debate about the safety of the use of nanoparticles due to their ability to promote alterations in gene expression, epigenetic patterns, iron homeostasis, and oxidative stress in vitro. Several papers report these different cell behaviours to different nanoparticles, but there is still no consensus on the real benefits and risks associated to nanoparticle exposure on a complex biological system. Hence, it is necessary to elucidate these risks in order to contribute with adequate therapy development and biological applications. Objective: To evaluate and distinguish possible cytotoxic and epigenetic effects on human submandibular gland (HSG) cancer cells exposed to maghemite nanoparticles functionalised with citric acid. Methodology: The NPM-citrate were synthesized by coprecipitation of Fe (II) and Fe (III) method and direct addition of citric acid. LDH and MTT were performed in order to evaluate cytotoxicity. Cell morphology was analysed by panoptic staining. Intracellular iron detection was assayed by the Prussian Blue. Methylation of DNA and Histone acetylation quantifications were performed by colorimetric assays. Gene expression of FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 was performed by qRT-PCR. For ROS production assay protocol for H2DCFA was performed. Results: No cytotoxic effects were observed on cells exposed to the tested concentrations of 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL. Although, cell morphology was found altered by both concentrations after 24h and 48h of exposure. Intracellular iron presence was also observed even after cease of exposure as well as intense generation of ROS. Furthermore, global DNA methylation and acetylation of histones H3 and H4 were also found to be altered. Histone 3 acetylation decreased to 38% and 62% after treatments with 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL, respectively. Hipoacetylation for H4 was even more accentuated and decreased from 82% to 4% and 10% after treatments of 0.5 mgFe/mL e 3.0 mgFe/mL, respectively. Differences between the gene transcripts accumulation were also reported: COX-2, FERRL and FERRH were found to be overexpresses, while DNMT3a decreased its transcript accumulation. Conclusion: We conclude that maghemite nanoparticles functionalized with citric acid were able to promote cytoplasmatic vacuolization, ROS generation, decreasing of global methylation pattern and acetylation of H3 and H4 and alteration on transcript accumulation of COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a and HDAC1 without impairment of HSG cells viability. This is the first report on the genetic and epigenetic effects of maghemite nanoparticles functionalized with citric acid on HSG cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/18140 |
| Date | 31 March 2015 |
| Creators | Cunha, Mariana Colaço Pereira Carneiro da |
| Contributors | Fonseca, Márcio José Poças |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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