O reparo de lesões genômicas tem papel critico na supressão da transformação maligna. Para melanomas, tipo de câncer de pele, lesões causadas por UV são responsáveis pela aquisição do fenótipo maligno. A via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) exerce função importante na correção destas lesões, sendo na proteína XPC um dos seus principais agentes atuantes no reconhecimento das lesões. Enquanto mutações em XPC predispõem à Xeroderma Pigmentosum, modulações na função de XPC podem exercer papel critico na aquisição de mutações UV em melanomas esporádicos. A modulação pode ocorrer por ação transcricional, interação proteica ou também por fatores genéticos que possam interferir com sua expressão e/ou atividade. Para entender o papel da transcrição na modulação do reparo exercido por XPC, verificou-se o papel de p53 neste contexto. Comparando-se linhagens com diferentes status funcionais de p53 frente a lesões UVB, os resultados indicaram seu papel quanto a diferenças na sensibilidade à exposição, expressão de proteínas de reparo e cinética de reparo de lesões CPD. Além disso, caracterizou-se a expressão de proteínas envolvidas com apoptose e a ativação de caspase 3/7, além da expressão de espécies reativas de oxigênio produzidas após UVB, as quais sugeriram um efeito pró-sobrevivência após neutralização destas moléculas. Com relação à modulação de XPC quanto a seu principal partner, hHR23B, procurou-se verificar seu papel na biologia de melanomas. Análise da expressão de hHR23B em amostras de tecido de séries névicas, melanomas primários e metástases, demonstrou grande heterogeneidade de marcação principalmente em nevus e melanomas primários. Dados apresentados demonstraram que hHR23B esta relacionado à estabilidade e acúmulo de XPC, consequentemente alterando a eficiência de reparo de DNA para lesões UVB. O silenciamento de hHR23B modulou a morte celular após UVB de maneira a diminuir sua taxa, porém a longo prazo, tal sobrevivência não foi evidenciada. O silenciamento de hHR23B também afetou a sensibilidade à alguns agentes quimioterápicos. Para os possíveis efeitos genéticos na modulação de XPC, verificou-se o papel de polimorfismos genéticos existentes no gene. Análise de expressão alelo-específica do polimorfismo K939Q não sugeriu diferenças na expressão relacionadas a estas variantes polimórficas. Por fim, verificou-se o papel que p53 e NER poderiam exercer sobre a resposta à cisplatina. Usando as mesmas linhagens utilizadas para a resposta à UVB, verificou-se que, ao contrário, células possuindo atividade funcional de p53 apresentavam maior sensibilidade ao quimioterápico. Esta sensibilidade não se mostrou relacionada diretamente a expressão de proteínas de reparo como XPC e ERCC1, embora XPC tenha demonstrado estar relacionado à sensibilidade quando do uso de siRNA. Além disso, a restauração da atividade de p53 seja por uso de vetores virais ou através de inibidores de HDM-2 como Nutlin-3, demonstraram-se eficazes no intuito de aumentar a sensibilidade ao quimioterápico. Em conjunto, os resultados apresentados evidenciam o papel de diferentes fatores que possam modular a atividade de reparo de DNA frente à UVB e quimioterápicos, principalmente no que se refere ao eixo p53-hHR23B-XPC, pontuando-os como peças importantes na compreensão da biologia de melanomas em processos de carcinogênese, progressão e quimiorresistência / The repair of genomic lesions plays a critical role in the suppression of malignant transformation. For melanoma, a type of skin cancer, lesions caused by UV are responsible for the acquisition of the malignant phenotype. The nucleotide excision repair (NER) pathway has an important role in the repair of these lesions and XPC protein in one of its main active agents in lesion recognition. While mutations in XPC predispose to Xeroderma Pigmentosum, modulations in XPC function may play critical role in the acquisition of UV mutations in sporadic melanomas. The modulation may occur either by transcriptional activity, protein interaction or also by genetic factors that may interfere with their expression and / or activity. To understand the role of the transcription in modulating the DNA repair exerted by XPC, we verified the role of p53 in this context. Comparing cells lines with different p53 functional status after UVB injury, the results indicated its role regarding the differences in sensitivity, expression of repair proteins and DNA repair kinetics of CPD lesions. Moreover, we characterized the expression of proteins involved in apoptosis and the activation of caspase 3/7, besides the analysis of the expression of reactive oxygen species produced after UVB exposure. Such molecules suggested a pró-survival effect after UVB exposure due to results observed after neutralization. Regarding the modulation of XPC by its main partner, hHR23B, we verified its role in the biology of melanoma. HHR23B expression analysis in tissue samples series of nevus, primary melanoma and metastases showed critical heterogeneity stainning, especially in nevi and primary melanomas samples. Results indicated that hHR23B play a role in XPC stability and accumulation, altering the efficiency of DNA repair to UVB injury. Knocking-down of hHR23B by siRNA modulated cell death after UVB by decreasing its rate, but the long-term survival has not been demonstrated so. The knocking-down of hHR23B also affected sensitivity to some chemotherapeutic agents. Regarding the possible genetic effects in the XPC modulation, we verified the role of existing genetic polymorphisms inside the gene. Analysis of allele-specific expression of K939Q polymorphism did not suggest differences in expression related to these polymorphic variants. Finally, it was tested that the role p53 and NER may have on the response to cisplatin. Using the same cell lines used for the response to UVB, it was found that, in contrast, cells having functional activity of p53 showed greater sensitivity to chemotherapy. This sensitivity was not directly related to expression of DNA repair proteins such as XPC and ERCC1, although XPC has shown to be related to the sensitivity when using siRNA. In addition, the restoration of p53 activity by use of viral vectors or by HDM-2 inhibitors, such as nutlin-3, proved to be effective in order to increase the sensitivity to chemotherapy. Overall, the results demonstrate the role of different factors that may modulate the activity of DNA repair against UVB and chemotherapy, especially with regard to p53-hHR23B-XPC axis, selecting them as major players in the understanding of the melanoma biology regarding the processes of carcinogenesis, progression and chemoresistance
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13052015-103235 |
| Date | 20 February 2015 |
| Creators | Francisco, Guilherme |
| Contributors | Chammas, Roger |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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