Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist ein zentrales Enzym der NO/cGMP-Signalkaskade, das über die Aktivierung von NO zur Bildung des second messangers cGMP führt. Die NO-GC setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, sodass zwei Isoformen des Enzyms gebildet werden können (α1β1 und α2β1). Da die genaue Verteilung der beiden Isoformen im Colon nicht bekannt ist, wurde diese im ersten Teil dieser Arbeit charakterisiert. Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten die Expression beider Isoformen sowohl in der glatten Muskelschicht als auch in der Submukosa und Lamina propria. Dabei war die α1β1-Isoform ubiquitär, die α2β1-Isoform dagegen hauptsächlich im Bereich des myenterischen Plexus vorzufinden.
In der glatten Muskelschicht des Colons ist die NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sowie Fibroblasten-ähnliche Zellen (FLC) exprimiert und hauptsächlich in die Modulation der gastrointestinalen Motilität involviert. Zur spezifischen Charakterisierung der Funktion der NO-GC in den einzelnen Zelltypen wurden Knockout-Mäuse generiert, denen die NO-GC global (GCKO) oder spezifisch in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) oder beiden Zelltypen (SMC/ICC-GCKO) fehlt. Anhand dieser Mausmodelle sollten im zweiten Teil dieser Arbeit die modulatorischen Effekte der NO-GC auf die spontanen Kontraktionen des Colons bestimmt werden. Zur Charakterisierung der spontanen Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht wurden Myographiestudien mit 2,5 mm langen Colonringen durchgeführt. Hierbei konnten drei verschiedene Kontraktionen gemessen werden: Kleine, hochfrequente Ripples, mittlere Kontraktionen und große Kontraktionen. Die detaillierte Analyse der einzelnen Kontraktionen zeigte einerseits eine NO-unabhängige Regulation der Ripples, andererseits eine NO-abhängige Modulation der mittleren und großen Kontraktionen über die NO-GC in SMC und ICC. Die NO-GC in SMC beeinflusst die Kontraktionen vermutlich vor allem über die Regulation des Muskeltonus der zirkulären Muskelschicht. Die NO-GC in ICC dagegen modifiziert die spontanen Kontraktionen möglicherweise über eine Veränderung der Schrittmacheraktivität. Allerdings führt erst ein Funktionsverlust des NO/cGMP-Signalweges in beiden Zelltypen zu einem sichtbar veränderten Kontraktionsmuster, das dem von globalen Knockout-Tieren glich. Dies weist auf eine kompensatorische Wirkung der NO-GC im jeweils anderen Zelltyp hin.
Zur Analyse der propulsiven Kontraktionen entlang des gesamten Colons wurden Videoaufnahmen der Darmbewegungen in Kontraktionsmusterkarten transformiert. Zudem wurde der Darm durchspült und die Ausflusstropfen aufgezeichnet, um die Effektivität der Kontraktionen beurteilen zu können. Hierbei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des NO/cGMP-Signalweges eine verminderte Effektivität der Kontraktionen zur Folge hat und vermutlich durch eine beeinträchtige Synchronisation der Kontraktionen erklärt werden kann. In diesem Regulationsmechanismus konnte vor allem der NO-GC in SMC eine übergeordnete Rolle zugewiesen werden.
Der dritte Teil der Arbeit thematisierte den Befund, dass SMC-GCKO-Tiere ca. 5 Monate nach Tamoxifen-Behandlung Entartungen der Mukosa entwickelten. Diese Entartung war lediglich in Tamoxifen-induzierten Knockout-Tieren vorzufinden. Histologische Analysen identifizierten die Entartungen als tubulovillöses Adenom. Die Genexpressionsanalyse von Mukosafalten von SMC-GCKO- und heterozygoten Kontrolltieren zeigte eine Vielzahl von Genen, welche spezifisch bei colorectalem Karzinom differenziell exprimiert sind. Einer dieser Faktoren war der BMP-Antagonist Gremlin1. Dieser Faktor erschien von besonderem Interesse, da er in Zellen der Lamina muscularis mucosae und kryptennahen Myofibroblasten exprimiert wird. Immunhistochemische Analysen ließen vermuten, dass diese Zellen sowohl die NO-GC als auch die Cre-Rekombinase unter dem SMMHC-Promotor exprimieren. Diese Arbeit liefert demnach Hinweise darauf, dass die NO-GC einen wichtigen Regulator innerhalb der Stammzellnische bildet. Die Deletion der NO-GC führt vermutlich zu einer verstärkten Bildung bzw. Sekretion von Gremlin1, was die Homöostase der mukosalen Erneuerung stört und somit zur Entwicklung von Adenomen führt. / The NO/cGMP signalling cascade is involved in many physiological processes. NO sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) is a key enzyme of this cascade, which is activated by NO and leads to the generation of the second messenger cGMP. As NO GC is comprised of two subunits two different isoforms exist (α1β1 und α2β1). However, the detailed distribution of the two isoforms in the colon is not known. Therefore, in the first part of this thesis, immunohistochemical staining and in situ hybridization was performed. The results showed NO-GC expression in the smooth muscle layer as well as in the submucosa and the lamina propria. Whereas the α1β1 isoform is expressed ubiquitously, expression of the α2β1 isoform is concentrated on the myenteric plexus.
In the smooth muscle layer, NO-GC expression has been shown specifically in smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC) and fibroblast-like cells (FLC). The function has been mainly associated with modulation of gastrointestinal motility. To specify the role of NO-GC on colonic motility in each cell type, mice lacking NO-GC globally (GCKO) or specifically in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) or in both (SMC/ICC-GCKO) were used. First, organ bath studies were performed using small proximal colonrings of 2,5 mm size. These measurements showed three different contractions: small, high frequency ripples, intermediate contractions and large contractions. For each contraction type, NO dependence was analyzed: Ripples are regulated in a NO-independent manner. In contrast, intermediate and large contractions are modulated by NO via a mechanism involving both ICC and SMC: NO GC in SMC most likely modulates contractions by setting muscle tone, whereas NO GC in ICC interacts with the pacemaker activity.
Moreover, contractions along the whole colon were analyzed using spatiotemporal maps. These measurements revealed NO-GC to be related to the efficiency of propulsive long distance contractions (LDC). Impaired NO-GC signalling (e.g. in SMC-GCKO, GCKO mice or in the presence of NOS inhibitor L-NAME) resulted in altered appearance of LDC. Some of these LDC did not produce outflow. Thus, our results indicate a prominent role of NO-GC in SMC to synchronize contractions along the colon to result in effective propulsion.
The third part of the study focused on the potential involvement of NO-GC in adenoma development. This hypothesis was set up based on the observation that colon of SMC GCKO mice showed mucosal swellings five month after tamoxifen treatment. Histological analysis assumed the mucosal swellings as tubulovillous adenoma. Subsequent gene expression analysis of mucosal folds of SMC-GCKO and heterozygous control mice identified a variety of differentially expressed genes, among them the BMP antagonist Gremlin1. This factor is potentially influenced by NO-GC as it is expressed by cells of the lamina muscularis mucosae and myofibroblasts closely located to the colonic crypts. Immunohistochemical analysis of tdTomato reporter mice assumed the same cells to express NO-GC under control conditions and active Cre recombinase in SMC-GCKO colon. Thus, this work hypothesizes NO-GC to be involved in the regulation of mucosal renewal. Deletion of NO-GC likely increases Gremlin1 generation and/or secretion, leading to altered mucosal renewal and finally resulting in adenoma development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:15989 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Beck, Katharina |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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