As galectinas são proteínas que se ligam a -galactosídeos por meio do domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD do inglês, Carbohydrate Recognition Domain) e que participam de vários processos de reconhecimento celular, sinalização, adesão e destinação intracelular de proteínas recém-sintetizadas. A primeira galectina, Galectina-1 (Gal-1), foi identificada em 1976 e possui um papel importante na progressão e proliferação tumoral, angiogênese, resistência a drogas e processos inflamatórios. Assim, é interessante a construção de dispositivos com Galectinas imobilizadas, preservando o CRD para o estudo de mecanismos e/ou detecção destas doenças. Neste trabalho a produção e caracterização de uma proteína recombinante fusionada, a MBP-Gal-1, foi descrita. A proposta do projeto foi pautada na hipótese de que a fusão da MBP à Gal-1 seria uma excelente estratégia para imobilização orientada da proteína de interesse, (Gal-1), sobre eletrodos modificados com filme polimérico, auxiliando na preservação da atividade da biomolécula imobilizada para posterior desenvolvimento de biossensor. A MBP-Gal-1 foi purificada utilizando 2 colunas com resinas diferentes: sepharose/lactose e amilose onde foi possível comprovar a atividade/preservação dos sítios ativos da Gal-1 e MBP, respectivamente. A proteína fusionada teve seu estado oligomérico estimado e seu raio hidrodinâmico determinado pela técnica Espalhamento Dinâmico da Luz sendo que a mesma se encontrava na forma monomérica com raio hidrodinâmico de 4 nm ± 1,26. A massa molecular de 57,834 kDa para a MBP-Gal-1 foi obtida através da técnica de Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF. O PPB, material polimérico empregado na modificação dos eletrodos de carbono vítreo e ouro, foi sintetizado e teve sua estrutura confirmada pela técnica de Ressonância Magnética Nuclear; este material foi utilizado para a realização dos ensaios de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) para a construção do biossensor. Os ensaios EIE utilizando eletrodo de carbono vítreo modificado com PPB mostraram a importância da imobilização orientada da sonda (MBP-Gal-1) para garantir a preservação da atividade biológica da mesma, uma vez que os resultados relativos ao aumento da Resistência à Transferência de Carga (Rtc), após adição do alvo (lactose), foram da ordem de 80% a mais para a proteína fusionada MBP-Gal-1 quando comparados à proteína nativa Gal-1. Os ensaios de SPR revelaram maior SPR efetiva para a MBP-Gal-1 imobilizada sobre superfície de eletrodo Au-SPR modificado com PPB o qual apresentou bom desempenho na detecção de lactose. / Galectins are proteins that bind to -galactosides by the Carbohydrate Recognition Domain (CRD) and participate in various processes of cell recognition, signaling, adhesion and intracellular destination of newly synthesized proteins. The first galectin, Galectin-1 (Gal-1), was identified in 1976 and plays an important role in tumor progression and proliferation, angiogenesis, drug resistance and inflammatory processes. Thus, it is interesting to desing devices with immobilized Galectins, preserving its CRD for the study of mechanisms and /or detection of such diseases. In this work the production and characterization of a fused recombinant protein, MBP-Gal-1, has been described. The project goal was based on the hypothesis that the fusion of the MBP to Gal-1 would be an excellent strategy for oriented immobilization of the protein of interest, (Gal-1), onto PPB- modified electrodes, promoting the preservation of the biomolecule activity immobilized for further development of a biosensor. MBP-Gal-1 was purified using 2 columns with different resins: sepharose/lactose and amylose and it was possible to prove the activity/preservation of both CRDs from Gal-1 and MBP, respectively. Dynamic Light Scattering showed that MBP-Gal-1 was in a monomeric form and with a hydrodynamic radius of 4 nm ± 1,26. The molecular mass of 57.834 kDa for MBP-Gal-1 was obtained by the technique of MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry. The PPB, a polymeric material used in the modification of glassy carbon and gold electrodes, was synthesized and its structure was confirmed by the Nuclear Magnetic Resonance (NMR); this material was used to carry out the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plasmon Resonance (SPR) tests for the construction of the biosensor. EIS assays using PPB-modified glassy carbon electrode showed the importance of probe-immobilization (MBP-Gal-1) to ensure the preservation of the biological activity of the protein, since the results related to the increase in Resistance of Charge Transfer (Rct), after addition of the target (lactose), were 80% higher for the fused protein MBP-Gal-1 when compared to the Gal-1 native-form protein. The SPR assays revealed a greater effective SPR for MBP-Gal-1 immobilized onto PPB-modified Au-SPR electrode surface which showed good performance in the detection of lactose.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11102018-100311 |
| Date | 10 August 2018 |
| Creators | Gomes, Pâmela Oliveira Martins |
| Contributors | Naal, Zeki |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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