Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a worldwide pathogen associated with
important losses to livestock production. Most of these losses come from reproductive
disorders and from the ability of the virus to produce persistent infections following in utero
infection of the fetus. A number of reverse genetics methodologies have been used for BVDV
in order to better understand the biology of the virus, which allowed the elucidation of a
number of biological features including virus replication, host-virus interaction, immune
response, and the pathogenesis of fetal infection. The present study describes the construction,
characterization and manipulation of an infectious clone out of a non-cytophatic Brazilian
BVDV strain IBSP4-ncp. The cDNA recombinant clone was constructed by yeast
homologous recombination with a low-copy vector, from three genomic fragments
comprising the open reading frame (ORF). The two untranslated regions (5' and 3' UTR) were
replaced by the respective UTRs of the reference strain NADL. The constructed vector was
transcribed in vitro and the resulting RNA was transfected on MDBK cells to rescue
infectious virus. The rescued viruses (IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 and #3) were maintained for
ten passages in tissue culture and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus
size and morphology similar to those of the parental IBSP-4. Genomic analysis revealed five
point mutations in the gene coding for Npro protein, resulting in amino acid changes. These
mutations probably reflect an adaptation of the virus to the heterologous UTRs. The infectious
clone IC-pBSC_IBSP4-ncp#2 was further used for the construction of a recombinant virus
expressing the Gaussia luciferase (Gluc) reporter gene. The reporter gene was inserted
between the Npro and Core genes, being flanked by an upstream linker and a downstream
sequence of the Foot and Mouth Disease virus protease (FMDV2Apro) for accurate protein
processing. The recombinant vector was in vitro transcribed and the RNA was transfected on
MDBK cells. Recombinant infectious viruses were rescued (IC-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 and
#4) and characterized in vitro, showing replication dynamics, focus size and morphology
similar to those of the parental IBSP-4 clone. The Gluc reporter gene was accurately
expressed and processed by the recombinant virus during 15 passages in tissue culture. These
studies revealed that the infectious clone constructed herein can be easily manipulated and is
able to carry in its genome heterologous genes up to 555 base pairs in length in a stable
fashion and without interference with its replication efficiency. Thus, the constructed clone
may be very useful for genetic manipulation towards studying different aspects of the BVDV
biology and its interactions with the host, and for the development of vaccine strains with
attenuated phenotype and/or with antigenic markers. / O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um patógeno de bovinos distribuído
mundialmente, associado com importantes perdas econômicas. As maiores perdas devem-se
aos problemas reprodutivos causados pela infecção, e pela capacidade do vírus de causar
persistência após infecção fetal no terço inicial da gestação. Para entender melhor a biologia
desse vírus, sistemas de genética reversa foram desenvolvidos e tem permitido a elucidação
de vários aspectos da replicação viral, interação vírus hospedeiro, resposta imune e
patogenia da infecção fetal. O presente estudo relata a construção, caracterização e
manipulação de um clone infeccioso, a partir da cepa brasileira não-citopática IBSP4-ncp. O
clone de DNA recombinante foi construído pela técnica de recombinação homóloga em
levedura, utilizando um vetor de baixo número de cópias, construído a partir de três
fragmentos genômicos, que compreendiam a fase aberta de leitura (open reading frame, ORF)
do vírus. As duas regiões não traduzidas (5 e 3 UTR) foram substituídas pelas respectivas
UTRs da cepa de referência NADL. O vetor construído foi transcrito in vitro e o RNA obtido
foi transfectado em células MDBK para recuperação de vírus infecciosos. Os vírus
recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncp#2 e #3) foram mantidos por 10 passagens em cultivo
celular e caracterizados in vitro, apresentando dinâmica de replicação, tamanho e morfologia
de focos similares ao vírus parental IBSP-4. A análise do genoma por sequenciamento revelou
cinco mutações pontuais no gene Npro, com trocas de aminoácidos, provavelmente refletindo
uma adaptação do vírus às UTRs heterólogas. O clone infeccioso construído CIpBSC_
IBSP4-ncp#2, foi então utilizado para a construção de um vírus recombinante
expressando o gene repórter Gaussia luciferase (Gluc). O gene repórter foi inserido entre os
genes Npro e Core do vírus. Para o processamento da proteína repórter, uma sequência ligante
foi adicionada anteriormente ao gene, e a sequência da protease do vírus da Febre Aftosa
(FMDV2Apro) foi inserida após o gene. O vetor recombinante construído foi transcrito in vitro
e o RNA obtido foi transfectado em células MDBK. Vírus recombinantes infecciosos foram
recuperados (CI-pBSC_IBSP4-ncpGluc#3 e #4) e caracterizados in vitro, apresentando
dinâmica de replicação, tamanho e morfologia de focos similares ao vírus obtido do clone
infecioso. O gene repórter Gluc foi corretamente expresso e processado pelo vírus
recombinante durante 15 passagens em cultivo celular. Com os resultados obtidos nestes
estudos, conclui-se que o clone infeccioso construído pode ser facilmente manipulado e é
capaz de carrear em seu genoma, e expressar de forma estável, genes heterólogos com até 555
pares de base, que parecem não interferir com sua capacidade replicativa. Dessa forma, o
clone obtido pode ser muito útil para manipulação genética visando estudar diferentes
aspectos da biologia do BVDV e de suas interações com o hospedeiro, assim como para a
produção de cepas vacinais com fenótipo atenuado e/ou com marcadores antigênicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4068 |
| Date | 29 March 2012 |
| Creators | Arenhart, Sandra |
| Contributors | Flores, Eduardo Furtado, Gil, Laura Helena Vega Gonzales, Weiblen, Rudi, Kreutz, Luiz Carlos, Spilki, Fernando Rosado |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 300, 300, 300, 300, 300, 300, 1cd49172-b6b6-4db1-b27e-daf2b145ba82, 136e1b53-cb40-4c1e-b9ec-1794c9a7edea, 1196f202-f5ba-46d5-8263-a331b85cc477, 37ea9445-0e57-453a-8f64-0498986410d8, 2700d56a-cb01-4915-8552-248ffaf3ea12, 3ceed1dd-ad30-4203-9bf4-099fbe96fc14 |
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