FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo de fatores de crescimento e de receptores de hormÃnios em folÃculos secundÃrios de caprinos. AlÃm disso, visa quantificar a expressÃo dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressÃo gÃnica em folÃculos secundÃrios caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia, folÃculos secundÃrios (150-200 Âm) foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de DNA complementar, realizou a quantificaÃÃo dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (GAPDH, β-tubulina, β-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormÃnio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressÃo de BMP-6 e BMP-7, folÃculos primordiais, primÃrios e secundÃrios, bem como pequenos e grandes folÃculos antrais foram obtidos e os nÃveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presenÃa ou ausÃncia de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folÃculos secundÃrios e sobre a expressÃo de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada apÃs 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e β-actina sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos prÃ-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nÃvel de mRNA. O nÃvel de mRNA para BMP-6 em folÃculos primÃrios e secundÃrios foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os nÃveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas cÃlulas da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folÃculos antrais. ApÃs o cultivo de folÃculos secundÃrios durante 6 dias, FSH aumentou o diÃmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os nÃveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Jà a BMP-6 na presenÃa ou ausÃncia de FSH aumentou o diÃmetro dos folÃculos secundÃrios. AlÃm disso, FSH aumentou os nÃveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os nÃveis de mRNA para FSH-R, apÃs o perÃodo de cultivo. Em conclusÃo, UBQ e β-actina sÃo os dois genes mais estÃveis para folÃculos secundÃrios caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folÃculos prÃ-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo. / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth
factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the
expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to
evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary
follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary
follicles (150-200 μm) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total
RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by
real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, β-tubulin, β-actin,
PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF,
KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of
BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large
antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in
vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or
absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression
of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed
that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and
KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral
follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher
and lower levels or RNA, respectively. UBQ and β-actin genes were the mostr stable
reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary
and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the
levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than
in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased
follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP-
7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter
of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the
levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for
FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and β-actin are the two most
stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the
growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:3386 |
| Date | 23 February 2010 |
| Creators | Isana Mara AragÃo Frota |
| Contributors | Josà Roberto Viana Silva, FabrÃcio Sousa Martins, Alice Andrioli Pinheiro |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Biotecnologia (Campus da UFC em Sobral-CE), UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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