The Venus flytrap, \textit{Dionaea muscipula}, with its carnivorous life-style and its highly
specialized snap-traps has fascinated biologist since the days of Charles Darwin. The
goal of the \textit{D. muscipula} genome project is to gain comprehensive insights into the
genomic landscape of this remarkable plant.
The genome of the diploid Venus flytrap with an estimated size between 2.6 Gbp to
3.0 Gbp is comparatively large and comprises more than 70 % of repetitive regions.
Sequencing and assembly of genomes of this scale are even with state-of-the-art
technology and software challenging. Initial sequencing and assembly of the genome
was performed by the BGI (Beijing Genomics Institute) in 2011 resulting in a 3.7 Gbp
draft assembly. I started my work with thorough assessment of the delivered assembly
and data. My analysis showed that the BGI assembly is highly fragmented and
at the same time artificially inflated due to overassembly of repetitive sequences.
Furthermore, it only comprises about on third of the expected genes in full-length,
rendering it inadequate for downstream analysis.
In the following I sought to optimize the sequencing and assembly strategy to obtain
an assembly of higher completeness and contiguity by improving data quality and
assembly procedure and by developing tailored bioinformatics tools. Issues with
technical biases and high levels of heterogeneity in the original data set were solved
by sequencing additional short read libraries from high quality non-polymorphic DNA
samples. To address contiguity and heterozygosity I examined numerous alternative
assembly software packages and strategies and eventually identified ALLPATHS-LG
as the most suited program for assembling the data at hand. Moreover, by utilizing
digital normalization to reduce repetitive reads, I was able to substantially reduce
computational demands while at the same time significantly increasing contiguity of
the assembly.
To improve repeat resolution and scaffolding, I started to explore the novel PacBio
long read sequencing technology. Raw PacBio reads exhibit high error rates of 15 %
impeding their use for assembly. To overcome this issue, I developed the PacBio
hybrid correction pipeline proovread (Hackl et al., 2014). proovread uses high
coverage Illumina read data in an iterative mapping-based consensus procedure to
identify and remove errors present in raw PacBio reads. In terms of sensitivity and
accuracy, proovread outperforms existing software. In contrast to other correction
programs, which are incapable of handling data sets of the size of D. muscipula
project, proovread’s flexible design allows for the efficient distribution of work load on high-performance computing clusters, thus enabling the correction of the Venus
flytrap PacBio data set.
Next to the assembly process itself, also the assessment of the large de novo draft
assemblies, particularly with respect to coverage by available sequencing data, is
difficult. While typical evaluation procedures rely on computationally extensive
mapping approaches, I developed and implemented a set of tools that utilize k-mer
coverage and derived values to efficiently compute coverage landscapes of large-scale
assemblies and in addition allow for automated visualization of the of the obtained
information in comprehensive plots.
Using the developed tools to analyze preliminary assemblies and by combining my
findings regarding optimizations of the assembly process, I was ultimately able to
generate a high quality draft assembly for D. muscipula. I further refined the assembly
by removal of redundant contigs resulting from separate assembly of heterozygous
regions and additional scaffolding and gapclosing using corrected PacBio data. The
final draft assembly comprises 86 × 10 3 scaffolds and has a total size of 1.45 Gbp.
The difference to the estimated genomes size is well explained by collapsed repeats.
At the same time, the assembly exhibits high fractions full-length gene models,
corroborating the interpretation that the obtained draft assembly provides a complete
and comprehensive reference for further exploration of the fascinating biology of the
Venus flytrap. / Die Venus Fliegenfalle, D. muscipula fasziniert aufgrund ihres karnivoren Lebensstil
und ihrer hochspezialisierten Fallen Biologen schon seit der Zeit von Charles Darwins.
Das Ziel des D. muscipula Genomprojekts ist es, neue Einblicke in den genomischen
Grundlagen dieser besonderen Pflanze zu gewinnen.
Die diploide Venus Fliegenfalle verfügt mit eine geschätzten Größe von 2.6 bp
bis 3Gbp über ein vergleichsweise großes Genom, das zudem zu über 70% aus
repetitiven Regionen besteht. Sequenzierung und Assembly von Genomen dieser
Größenordnung stellen selbst mit neusten technischen und informatischen Methoden
eine große Herausforderung dar. Zum ersten mal sequenziert und assembliert wurde
das Genom 2011 durch das BGI (Beijing Genomics Institute). Meine Arbeit am
Genom der Fliegenfalle begann mit der Analyse des 3.7Gbp großen Assemblies,
welches wir vom BGI erhalten haben. Mit meinen Untersuchungen könnte ich zeigen,
dass das Assembly stark fragmentiert und gleichzeitig durch überrepräsentierte
repetitive Sequenzen stark aufgebläht ist. Darüberhinaus beinhaltet es gerade ein
mal eine drittel der erwarteten Gene in Volllänge, wodurch es für die weiter Analyse
ungeeignet ist.
In meiner weiteren Arbeit habe ich mich daher darauf konzentriert, unsere Sequenzierungsund
Assemblierungsstrategie zu verfeinern um ein stärker zusammenhängendes und
vollständigeres Assembly zu erhalten. Dafür war es notwendig die Qualität der Sequenzierdaten
so wie den Assemblierungsprozess selbst zu optimieren, und Programme zu
entwickeln, die eine Verbesserung der Daten und eine Analyse der Zwischenergebnisse
ermöglichen. So wurden etwa zur neue Bibliotheken von nicht-polymorphen
DNA-Proben sequenziert um die Heterogenität im Datensatz zu verringern. Um die
Kontinuität der Assemblies zu verbessern und Probleme mit der Heterozygosität der
Daten zu lösen habe ich eine Reihe verschiedener Assemblierungsprogramme getestet.
Dabei zeigte sich, dass das Programm ALLPATHS-LG am besten geeignet ist für die
Assemblierung von D. muscipula Daten. Durch den Einsatz von digitaler Normalisierung
konnte ich den Bedarf an Computerressourcen für einzelne Assemblierungen
deutlich reduzieren und gleichzeitig die Kontinuität der Assemblies deutlich erhöhen.
Zur besseren Auflösung repetitiver Strukturen im Genom, habe ich auf eine neu
entwickelte Sequenziertechnologie von PacBio zurückgegriffen, die deutlich länger
Sequenzen erzeugt. Um die neuen Daten trotz ihrer hohen Fehlerrate von 15%
für Assemblierungen nutzen zu können, entwickelte ich das Korrekturprogramm
proovread (Hackl et al., 2014). proovread nutzt kurze Illumina Sequenzen mit hoher Sequenziertiefe um innerhalb eines iterativen Prozess Fehler in PacBio Daten ausfindig
zu machen und zu korrigieren. Das Programm erreicht dabei eine bessere Genauigkeit
und eine höhere Sensitivität als vergleichbare Software. Darüber hinaus erlaubt sein
flexibles Design auch Datensätze in der Größenordung des Fliegenfallengenoms
effizient auf großen Rechenclustern zu bearbeiten.
Neben dem Assemblierungsprozess an sich, stellt auch die Analyse von Assemblies
großer Genome eine Herausforderung dar. Klassische Methoden basieren oft auf
der rechenintensiven Berechnung von Alignments zwischen Sequenzierdaten und
Assembly. Um vergleichbare Analysen deutlich schneller generieren zu können, habe
ich Programme entwickelt die auf der Auswertung von k-mer Häufigkeiten beruhen,
und die gewonnenen Ergebnisse in übersichtlichen Graphiken darstellen.
Durch Kombination der so gewonnenen Einblicke und der verschiedenen Erkenntnisse
bezüglich der Optimierung es Assemblierungsprozesses, war es mir am Ende
möglich, ein Assembly von hoher Qualität für das Genom der Venus Fliegenfalle
zu rekonstruieren. Dieses habe ich weiter verfeinert, unter anderem durch das Entfernen
heterozygoter Sequenzen und durch das Flicken von Lücken mit Hilfe von
PacBio Daten. Das so erstelle Assembly besteht aus 86 × 103 Sequenzen und hat
eine Gesamtgröße von 1.45Gbp. Der Unterschied zur erwarteten Genomgröße
lässt sich dabei gut durch kollabierte repetitive Regionen erklären. Gleichzeitig untermauert
ein hoher Anteil an Volllängengenen im Assembly die Interpretation, dass das
vorliegende Assembly eine vollständiges und umfassendes Abbild der D. muscipula
Genom zeigt, und dass es sich damit als gute Grundlage für weitere Untersuchungen
zur Biologie dieser faszinierenden Pflanze eignet.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:13314 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Hackl, Thomas |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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