Der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 ist ein Fäkalisolat, das in der Medizin traditionell zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt wird. Durch erfolgversprechende klinische Studien zur Remissionserhaltung bei Colitis ulcerosa, bei denen EcN als therapeutische Alternative zur Standardmedikation eingesetzt wird, ist das Interesse an den Wirkmechanismen von Probiotika stark gestiegen. EcN gehört derzeit zu den am besten untersuchten Probiotika. Einige Wirkmechanismen konnten dadurch schon aufgeklärt werden. So sind vermutlich Strukturkomponenten und stammspezifische Syntheseleistungen an der Ausprägung des probiotischen Phänotyps von EcN beteiligt. Schlüssige Konzepte, die über Gene, Genprodukte und molekulare Mechanismen den probiotischen Effekt von EcN erklären, fehlen bislang. Im Rahmen dieser Arbeit wird das Genom von EcN analysiert und auf der Basis der Genomsequenz mit anderen E. coli-Stämmen verglichen. Mit Hilfe einer Promotor-Reporter-Fusionsbibliothek (Promotorbank) werden intestinal in vivo regulierte Gene identifiziert und dadurch neue Ansätze zur Untersuchung der probiotischen Eigenschaften von EcN geschaffen. Die Grundlage für die molekulare Analyse von EcN ist die manuelle Nachannotation seines sequenzierten Genoms. Die EcN-Sequenz wird mit 13 weiteren annotierten E. coli-Sequenzen verglichen. Nach dieser Analyse kodiert EcN derzeit 121 stammspezifische Gene. Die Genomstruktur ist mit den enthaltenen genomischen Inseln und Prophagen dem Genom des uropathogenen E. coli CFT073 sehr ähnlich. Mit wenigen Ausnahmen kodiert EcN alle in E. coli CFT073 vorhandenen Virulenz- und Fitnessfaktoren, so dass auf der Nukleotidebene die nahe Verwandschaft dieser beiden Stämme bestätigt werden kann. Zudem kann gezeigt werden, dass EcN in artifiziellen Systemen wie der Zellkultur oder gnotobiotischen Mäusen ein pathogenes Potenzial hat, obgleich die Kolonisierungsfähigkeit pathogener Bakterien durch Inkubation mit EcN herabgesetzt wird. Eine wichtige Rolle bei der Besiedlung des Intestinaltrakts und der Immunstimulation von Darmepithelzellen spielt auch die globale Regulation der Genaktivität bei EcN durch den alternativen Sigma-Faktor RpoS, der im Gegensatz zu rpoS-Deletionsmutanten zu einer gesteigerten mRNA-Expression des Tight-junction Proteins ZO-1 führt. Des Weiteren führte die Untersuchung von EcN-Deletionsmutanten zu der Schlussfolgerung, dass einige genomische Inseln für Eigenschaften, die das probiotische Verhalten erklären können, eine Rolle spielen. Durch den Einsatz einer Promotorbank von EcN in konventionellen und gnotobiotischen Mäusen werden erstmalig Sequenzen von intestinal in vivo aktiven Promotoren identifiziert. Der Aufbau eines Promotor-Reportergen-Assays mit dem Biolumineszenz erzeugenden luxCDABE-Operon ermöglichte die Untersuchung ausgewählter Promotoren in vitro. Mit einem In Vivo Imaging System (IVIS) kann in weiteren Experimenten die Aktivität dieser Promotoren in lebenden Mäusen untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, dass EcN kein vollkommen harmloser probiotischer Stamm ist. Weitere Informationen über EcN sind dehalb wichtig für eine optimierte Anwendung als Therapeutikum. Die molekulare Analyse ist somit eine unbedingt notwendige Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Eigenschaften von EcN, die für seinen probiotischen Charakter verantwortlich sind. / The probiotic E. coli Nissle 1917 is a fecal isolate which is traditionally used for treatment of various gastrointestinal disorders. In clinical trials where EcN was used as therapeutic alternative for remission maintenance of ulcerative colitis compared to standard medication, promising results led to an increased interest in probiotics. Today, EcN is one of the best studied probiotics. Therefore, several mechanisms of action could be enlightened. Structural components and strain-specific products are responsible for its probiotic effects. But conclusive concepts about genes, gene products and molecular mechanisms that really contribute to the probiotic character of EcN have not been offered so far. In order to create new possibilities to elucidate the probiotic traits of EcN the genome is analysed by taking this as a basis for comparison to other E. coli genomes and identification of intestinal in vivo regulated genes using a promoter-trap-library. The sequenced EcN genome is annotated and compared to 13 other so far annotated E. coli genomes. Concerning these analyses EcN encodes 121 strain-specific genes. The genome structure including the genomic islands and prophages is highly homolog to the uropathogenic E. coli CFT073. EcN encodes most of the virulence and fitness factors that are present in E. coli CFT073. Therefore, the close relationship of these two strains is confirmed at nucleotide level. Furthermore, it is shown that in artificial systems like cell culture assays and gnotobiotic mice EcN reveals a pathogenic potential although EcN is able to decrease colonization efficiency of pathogenic bacteria. The alternative sigma factor RpoS that is responsible for global regulation and activity of several genes seems to play an important role during colonization of EcN in the intestine and its immunostimulatory effects on intestinal epithelial cells. Investigation of EcN-deletion mutants lacking genomic islands and prophages lead to the conclusion that some genomic islands may play a role for specific probiotic traits. This is the first time where a promoter-trap-library was used in conventional and gnotobiotic mice for collection of intestinal in vivo active promoters. Constructing and establishing a promoter-reporter gene assay with the bioluminescent luxCDABE operon made the investigation of selected promoters in vitro possible as well as establishing a bioluminescence assay using an In Vivo Imaging System (IVIS) for investigation of promoter activity in living mice. In this research project was shown that EcN is not a completely harmless probiotic. The genome structure and regulatory mechanisms of gene expression are the strain’s molecular traits that lead to probiotic activity and immunostimulatory effects. Therefore, the molecular analyses presented here, together with the complete genome sequence, are a basis for further investigations of mechanisms that are responsible for the probiotic effects of EcN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:23738 |
| Date | 15 May 2009 |
| Creators | Schmidt, Dorothea |
| Contributors | Gunzer, Florian, Röske, Isolde, Buer, Jan |
| Publisher | Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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