As células germinativas primordiais (CGPs) são as precursoras dos gametas, capazes de gerar um novo indivíduo os quais transmitirão os materiais genéticos para as futuras gerações. Normalmente, a linha germinal de mamífero é determinada por fatores genéticos e epigenéticos que possuem funções essenciais para guiar na direção e desenvolvimento das CGPs, bem como das células germinativas embrionárias (CGEs). A reprogramação epigenética é fundamental para a regulação do genoma durante o desenvolvimento das células germinativas responsáveis por originar a linhagem gametogênica nos mamíferos. A metilação e desmetilação em CGPs são um evento único, essencial para apagar a memória epigenética e também prevenir transmissões de epimutações para a próxima geração. Assim, o completo entendimento das vias e mecanismos para a migração inicial e diferenciação destas células em CGEs podem ser importantes para identificar e corrigir falhas possíveis nesses processos, o que será importante, no futuro, para o desenvolvimento e desempenho reprodutivo. A maioria dos estudos com CGPs e CGEs é realizado em camundongos, porém nem sempre esta espécie torna-se o melhor modelo de estudo quando se quer transpor esses conhecimentos a humanos. O cão doméstico (Canis lúpus familiaris) apresenta-se como um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento em mamíferos, pois possui inúmeras similaridades com a bioquímica, fisiologia e genética. Deste modo, torna-se interessante expandir os estudos sobre as CGPs e CGEs na espécie canina, a fim de mostrar a importância de diferentes modelos que se assemelham a seres humanos. Portanto, objetiva-se, nesta proposta, identificar qual é a dinâmica de marcadores pluripotentes, germinativos e epigenéticos que são importantes para o desenvolvimento das CGPs e CGEs caninas. Para tal procedimento, essa pesquisa foi dividida em duas fases: a primeira, consiste no processo in vivo, desde o desenvolvimento inicial do embrião até a completa formação da crista gônadal. Análises de RTq-PCR e imunofluorescência para marcadores pluripotentes POU5F1 (OCT4) e NANOG, germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2 foram realizados para criar um perfil de genes que são importantes para o desenvolvimento das CGPs caninas. Prosseguiu-se para a segunda fase in vitro, que incide na derivação e caracterização das CGEs caninas. Ensaios de Fosfatase Alcalina, imunofluorescência para os marcadores: pluripotente POU5F1 (OCT4), germinativos DDX4 (VASA), DAZL e DPPA3 (STELLA), mesodérmico THY-1 (CD90) e epigenéticos 5mC, 5hmC, H3K27me3 e H3K9me2, RT-qPCR para os genes NANOG e DDX4 e formação de teratoma foram efetivados para comprovar a linhagem de células CGEs. Como resultado in vivo, percebe-se que diferentes padrões de marcações e genes foram expressos nas CGPs, comprovando que a espécie canina se assemelha mais com os humanos do que com os camundongos. Os resultados in vitro mostraram que foi possível derivar as células CGEs e que estas conseguem reter sua pluripotencialidade e que diminuem a expressão dos genes germinativos. Porém, essas células tendem a se diferenciar em outros tecidos somáticos, mesmo com a adição de suplementos, fato também notado em CGEs humanas. / Primordial germ cells (PGCs) are known as the only cells capable of generating a new individual, they originate the gametes which then will transmit genetic material to future generations. Normally, the mammalian germ line is determined by genetic and epigenetic factors that have essential functions to guide the direction and development of PGCs as well as embryonic germ cells (EGCs). Epigenetic reprogramming is fundamental for the regulation of the genome during the development of the germ cells responsible for originating the gametogenic lineage in mammals. Methylation and demethylation in PGCs is a unique event, essential for erasing epigenetic memory and also preventing transmissions of epimutations to the next generation. Thus, the understanding of the patterns of differentiation of PGCs in EGCs can be important in identifying and correcting possible failures in these processes, which will be important in the future for development and reproductive performance. Most of the studies with PGCs in EGCs are carried out in mice, but this species is not always the best model of study when transposing this knowledge to humans. In canines, no study has ever been reported on canine PGCs and maybe the Canine species has become interesting as a new animal model for studies. It is known that the study material of human embryos are scarce samples and difficult to obtain, so it is necessary to use other animal models, such as the Canids, which also resemble humans. Dogs were the first fundamental models for the development of bone marrow transplantation in humans, but also made valuable contributions to the development of therapies for cardiovascular and orthopedic diseases. Then, it has become interesting to expand the studies on PGCs in the canine species in order to show the importance of different models that might resemble humans. Therefore, we had how proposal identify which were pluripotent, germinative and epigenetic markers that are important for the development of PGCs and canine EGCs. It research was divided into two phases: the first consists of the in vivo process, from the initial development of the embryo to the complete formation of the gonadal ridge. We analyzed through the techniques of real-time PCR (RT-qPCR) and immunofluorescence for pluripotent markers POU5F1 (OCT4) and NANOG, germline DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2 were performed to create a profile of genes that are important for the development of canine PGCs. We proceeded to the second in vitro phase, which focuses on the derivation and characterization of canine EGCs. Alkaline Phosphatase (AP), immunofluorescence for the markers: pluripotent POU5F1 (OCT4), germinative DDX4 (VASA), DAZL and DPPA3 (STELLA), mesodermal THY-1 (CD90) and epigenetic 5mC, 5hmC, H3K27me3 and H3K9me2. We also analyzed RT-qPCR for NANOG and DDX4 genes and teratoma formation were performed to prove the EGCs cell lineage. As a result in vivo, different marking patterns and genes had been expressed in CGPs, proving that the canine species is more similar to humans than to mice. The in vitro results showed that it was possible to derive the EGCs and that they are able to retain their pluripotency and decrease the expression of the germinative genes. However, these cells continue to differentiate into other somatic tissues, even with the addition of supplements, a fact also noted in human CGEs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-24042017-172715 |
| Date | 16 February 2017 |
| Creators | Aline Fernanda de Souza |
| Contributors | Daniele dos Santos Martins, Felipe Perecin, Fabiana Fernandes Bressan, Susana Marina Chuva de Sousa Lopes, Flavio Vieira Meirelles, Moyses dos Santos Miranda |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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