Este projeto teve como objetivo a produção de 1,3-propanodiol (1,3-PDO) utilizando glicerol como matéria prima, que pode ser proveniente da indústria de biodiesel. O 1,3-PDO é um produto de interesse na indústria biotecnológica, como precursor para diversos processos. Sua maior aplicação é na produção do bioplástico Politrimetileno Tereftalato (PTT), um termoplástico reciclável não biodegradável com qualidades superiores a do Polietileno Tereftalato (PET). Atualmente, o 1,3-PDO é produzido principalmente por síntese química, utilizando derivados do petróleo, mas a alternativa por microrganismos é vantajosa, pois gera menor emissão de poluentes, usa recursos renováveis e tem menor custo de produção. As bactérias apresentadas nesse trabalho são Escherichia coli recombinantes com genes da bactéria naturalmente produtora de 1,3-PDO Klebsiella pneumoniae. Analisando os dados da literatura, as Análises de Balanço de Fluxo (FBA) e dados experimentais, este projeto teve como objetivo eliminar total ou parcialmente os subprodutos lactato e acetato de E. coli recombinantes e analisar o impacto no metabolismo da bactéria e na produção de 1,3-PDO. Também foi o objetivo analisar o papel do gene yqhD na produção, combinando as mutações que produziam mais com as já obtidas, num esforço de melhorar o processo de produção estabelecido. Foram obtidas 4 linhagens da E. coli modificadas geneticamente, nas quais os seguintes genes foram alvos de estudo: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Também foram feitas combinações destas linhagens com uma cepa de E. coli já obtida com mutação na enzima Isocitrato Desidrogenase, na qual a especificidade por coenzimas foi alterada (NADP+ para NAD+), o que gerou mais 6 linhagens para estudo. Todos os genes propostos foram deletados e as linhagens tiveram a produção analisada. Com base em resultados preliminares foram construídas novas linhagens combinando as modificações, e todas tiveram a produção testada. A melhor das linhagens foi uma E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivada em biorreator. Foram observados aumentos no fator de conversão (até 0,489 molPDO/molglicerol) e produtividade (até 0,312gPDO.L-1.h-1). Mutantes derivadas desta, para produzir menos acetato, foram construídas e cultivadas em biorreator. Na tentativa de criar uma linhagem com potencial de ser usada na indústria, um gene essencial foi clonado no plasmídeo de produção, na tentativa de resolver problemas de larga escala. Esse novo plasmídeo, quando usado em uma linhagem específica, elimina a necessidade de usar antibiótico no meio e mantém o elevado número de cópias dos genes de interesse. Novos incrementos poderão ser obtidos explorando diferentes condições de oferta de oxigênio. Os objetivos iniciais foram alcançados: construir linhagens mais produtivas de 1,3-PDO e começar a estudar os efeitos da eliminação de genes responsáveis por alguns subprodutos na produção. Os resultados aqui obtidos ainda puderam indicar a importância de alguns genes, e agora perguntas mais específicas podem ser feitas, bem como hipóteses testadas. / This project aimed at producing 1,3-propanediol (1,3-PD) using glycerol as carbon source, which can be proven from the biodiesel industry. 1,3-PD is a significant product in biotechnology as a precursor to several processes. Its main application is as monomer of the bioplastic Polytrimethylene Terephthalate (PTT), a non-biodegradable recyclable thermoplastic with superior qualities over Polyethylene Terephthalate (PET). 1,3-PD is produced mostly by chemical synthesis from petroleum derivatives. The alternative produced by microorganisms is more advantageous due to the use of renewable raw material and the lower cost of production. The bacteria presented here are recombinant strains of Escherichia coli, harboring genes from the natural producer of 1,3-PD, Klebsiella pneumoniae. Reviewing the literature, simulations of Flux Balance Analysis (FBA) and experimental observations, this project aimed at eliminating partially or completely the lactate and acetate byproducts in strains of E. coli, and at understanding the effects of the mutations in production and growing. We also analyzed the role of the yqhD gene in the production of 1,3-PD, combining the mutations that produced more 1,3-PD with each other, to improve the current production process. Four recombinant strains of E. coli were first obtained in a first experimentation, in which the following genes were analyzed: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Combinations of these strains was also made with one previously obtained E. coli with mutation at the Isocitrate dehydrogenase enzyme, with specificity altered by coenzymes (NAD+ instead NADP+), resulting in 6 more strains. All genes of interest were deleted, and the mutants had the production evaluated. Based on preliminary results, new strains were constructed combining the modifications, all tested in shake flasks. The best strain for production was an E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivated in bioreactor. It was observed an increase in the yield (up to 0.489 molPDO/molglycerol) and productivity (up to 0.312 gPDO.L-1.h-1). Mutants lacking genes responsible for acetate formation were obtained from the best strain, in order to reduce acetate at batch. At last, in an attempt to create a strain with potential to be used in industry, an essential gene was cloned in the production plasmid, trying to solve some large-scale problems. This new plasmid used in a specific strain eliminate the use of antibiotics, and still preserve the high copy number of the genes of interest. Further improvements could be achieved by exploring different oxygen supply conditions. The initial objectives were achieved: to construct more productive strains of 1,3-PD and study the effect of the deletion of genes responsible of byproducts. Furthermore, the results obtained in this research could reveal the importance of some genes, and from here, more specific questions and hypothesis can be investigated.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06062019-141357 |
| Date | 13 December 2017 |
| Creators | Oliveira, Henrique da Costa |
| Contributors | Gomez, José Gregorio Cabrera |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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