As hidrolases de glicosídeos (GHs) exercem papéis fundamentais em vários processos biomédicos e aplicações industriais. A maioria destas enzimas possui vários domínios funcionais ligados entre si por peptídeos conhecidos como linkers. Informações sobre organização estrutural destas enzimas e sua mobilidade, posições e orientações mútuas de domínios individuais, bem como mudanças conformacionais introduzidas por ligantes ou por mudanças de condições bioquímicas (pH e T) podem ser muito informativas. Por esse motivo, é muito importante determinar a organização estrutural de GHs em termos de posição e orientação de seus domínios individuais e compreender a interação entre estes domínios em condições próximas às fisiológicas. Entretanto, atualmente, a conformação, dinâmica e função dos GHs com múltiplos domínios ainda não são totalmente compreendidas. Assim, o principal objetivo deste projeto foi conduzir estudos de hidrolases de glicosídeos em solução, usando SAS. Um grande número de GHs foi clonado e expresso em laboratório sob a direção do Prof. Dr. Igor Polikarpov (Grupo de Biotecnologia Molecular, IFSC / USP), seguindo protocolos já estabelecidos na literatura, para sua expressão e purificação. Experimentos SAXS foram realizados em colaboração com o Dr. Evandro Ares de Araújo (USP, São Carlos) e com o Prof. Dr. Mário de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Para estudar as hidrolases de glicosídeos, foi utilizado o método de espalhamento a baixo ângulo, e em adição ao trabalho experimental, foi desenvolvido um novo pacote de software SAXSMoW2 para processar os dados do SAXS. Este pacote permite obter rapidamente os principais parâmetros estruturais de moléculas de proteínas, calcular o peso molecular e o estado oligomérico. Também foi aperfeiçoado e aplicado o método de acoplamento estatístico (statistical coupling analysis) , para complementar os dados estruturais experimentais, em especial para xiloses isomerases. Este método pode permitir uma melhor compreensão da relação entre as características estruturais evolutivas e sua funcionalidade biológica. Além disso, métodos de bioinformática foram desenvolvidos para complementar e compreender melhor as informações estruturais obtidas nos experimentos de SAXS. O primeiro foi um método para separar sequências de GH7 em duas categorias, exo e endogluconases. É útil analisar cada tipo de proteína dentro da família separadamente e estudar o papel dos loops funcionais - características estruturais que influenciam significativamente a atividade biológica. Outro método foi desenvolvido para encontrar o centro de atividade na nova enzima Xilose Isomerase obtida, usando uma estrutura relacionada, bem conhecida, da mesma família. Este método foi aplicado a enzimas cujas estruturas foram estudadas pela técnica de cristalografia em nosso laboratório no IFSC / USP. Inspirado pelo SCA, um método de detecção de comunidades difusas de aminoácidos em proteínas foi desenvolvido. Essa informação também pode complementar os resultados do SCA, indicando conjuntos fortemente correlacionados de aminoácidos na enzima. Outro novo método desenvolvido é uma estimativa de afinidade nas famílias de enzimas ativas em carboidratos utilizando similaridade dos modelos escondidos de Markov e bancos de dados open access de sequências de proteínas. / The Glycoside Hydrolases (GHs) play a key role in a number of biomedical processes and industrial applications. Most of these enzymes are multidomain proteins composed of different functional domains connected by linker peptides. Thus, it is very important to determine structural organization of glycoside hydrolases in terms of positions and orientations of their individual domains and comprehend the interplay between their multiple domains under close-to physiological conditions. To study the glycoside hydrolases, in this work a small-angle scattering method has been used. Currently, the conformation, dynamics and function of GHs with multiple domains are not fully understood. This is why the information on their structural organization and mobility; mutual position and orientation of the individual domains and conformational changes induced by interaction with the substrates or difference in biochemical conditions might be very informative. A large number of GHs have been cloned and expressed in the lab under direction of Prof. Dr. Igor Polikarpov (Molecular Biotechnology group, IFSC/USP) and we follow already established protocols for their expression and purification. SAXS experiments have been carried out in collaboration with Dr. Evandro Ares de Araujo (USP, São Carlos) and Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto (UNESP, Botucatu). Additionally to experimental work, a new software package SAXSMoW2 for SAXS data processing has been developed. The software allows to obtain rapidly main structural parameters of the protein molecule, calculate molecular weight and oligomeric state. To supplement an structural data, the method of statistical coupling analysis (SCA) has been significantly improved and applied. The method allows a better understanding of interconnection between evolutionary caused structural features and their biological functionality. Also, various bioinformatic methods were developed to complete and understand better structural information obtained in SAXS experiments. The first one is a method for separating sequences from GH7 into the two bins of exo- and endogluconases. It is helpful to analyze each type of proteins inside the family separately and study the role of functional loops -- structural features that significantly influence on biological activity. Other developed method is for finding of activity center in the new obtained Xylose Isomerase enzyme using related well-known structure from the same family. This method was applied to the enzyme whose structure was studied using crystallography technique in our laboratory at IFSC/USP. Inspired by SCA, a method of aminoacid fuzzy communities detection in proteins has been developed as well. This information also can complete SCA results showing strong correlated sets of aminoacids in the enzyme. Another one new developed method is an estimation of carbohydrate-active family affiliation of unknown proteins using Markov hidden model similarities and open access databanks of protein sequences.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052019-173258 |
| Date | 07 March 2019 |
| Creators | Vasilii, Piiadov |
| Contributors | Polikarpov, Igor |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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