Catalyseurs de la dégradation de polysaccharides dans le cadre de diverses applications industrielles, de nombreuses glycoside hydrolases (GH) possèdent également une activité de transglycosylation qui peut être exploitée pour la synthèse d'oligosaccharides. Afin d'augmenter cette activité, minoritaire par rapport à l'hydrolyse, des expériences de mutagenèse rationnelle peuvent être employées. Toutefois, l'ensemble des bases moléculaires régissant l’équilibre entre ces deux activités reste en revanche difficile a élucider. L'étude de quatre GH (Ttβgly, AgaD, TcTS, TrSA) par simulation de dynamique moléculaire a permis la découverte de canaux d'eau internes à leurs structures et connectant le site actif au milieu. Cette observation suggère que les canaux d'eau internes aux GH pourraient être impliqués dans leur activité d'hydrolyse. Plusieurs paires de résidus bordant deux de ces canaux ont été mis en évidence chez Ttβgly et AgaD et semblent contrôler le passage de l'eau du canal vers le site actif. La mutagenèse de ces résidus a été entreprise afin de tenter d'augmenter l'activité de transglycosylation chez ces deux enzymes. Une réduction de l'hydrolyse d'un facteur 7 et 50 au profit de l'activité de transglycosylation a été caractérisée chez les deux meilleurs mutants de Ttβgly et AgaD, respectivement. L'analyse des simulations a révélé que ces résultats étaient corrélés à une augmentation de la dynamique des molécules d'eau internes aux deux canaux étudiés. Cette étude souligne ainsi l'importance fonctionnelle de l'eau interne aux hydrolases et suggère que l'ingénierie de sa dynamique peut constituer une approche originale pour convertir les GH en transglycosidases. / Known for their ability to hydrolyse glycosidic linkages,numerous glycoside hydrolases (GH) are also able tocatalyse transglycosylation reaction which can beharnessed for the synthesis of oligosaccharides. Althoughin the vast majority of cases hydrolysis prevails overtransglycosylation reaction, the latter has already beenincreased through mutagenesis and directed evolutionexperiments. However, little is known about the regulationof the balance between both activities. We discover, viamolecular dynamics (MD) simulations, several potentialwater channels connecting the bulk to the active site infour GH: Ttβgly, AgaD and the pair of homologsTcTS/TrSA. This observation supports the hypothesis thatchannels could be involved in the hydrolytic activity of GH.Amino acid residues forming bottlenecks at the interfacebetween two water channels and the active site in Ttβglyand AgaD were suspected to control water access fromthe bulk to the channel interior and the active site.Mutagenesis of key amino acids in the vicinity of selectedchannels was performed in order to attempt to increasethe transglycosylation/hydrolysis ratio balance.Characterization of the best mutants showed a 7 and 50fold decrease of hydrolysis compared to the wild type forTtβgly and AgaD respectively, while the transglycosylaseactivity was improved. MD simulations showed that thesemodifications were correlated with greater water dynamicsin the corresponding channels. These results highlight theimportance of water dynamics in hydrolases catalysis andsuggest that modifying the protein internal water dynamicscould serve as a generic approach to engineertransglycosylase activity in GH.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017NANT1044 |
| Date | 16 May 2017 |
| Creators | David, Benoît |
| Contributors | Nantes, Tellier, Charles, Sanejouand, Yves-Henri |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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