Haemophilus influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium aus der Familie der Pasteurellacaea. Das physiologische Merkmal von H. influenzae ist die essentielle, aber defiziente Hämin- und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) Biosynthese. Während Hämin für aerobes Wachstum benötigt wird, ist NAD+ sowohl für aerobes, als auch für anaerobes Wachstum essentiell. Als NAD+-abhängiger Organismus fehlen H. influenzae die meisten Enzyme für die NAD+-Biosynthese. Daher kann dieses Bakterium nur eine begrenzte Anzahl an Vorläufermolekülen, wie NAD+(P), Nikotinamid-Mono-Nukleotid (NMN) und Nikotinamid-Ribosid (NR) aus der Umwelt zur NAD+-Synthese nutzen. Andere NAD+-unabhängige Pasteurellacaea-Spezies, wie Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans, können auch kein NAD+ aus der de novo Biosynthese bereitstellen, diese Arten können aber zusätzlich auf Nikotinamid (NAm) wachsen. Die Erforschung des NAD+-Aufnahmesystems kann für die Entwicklung antimikrobieller Therapeutika von großem Interesse sein. Von unserer Arbeitsgruppe wurde die NAD+-Aufnahmeroute aufgeklärt; so werden NAD+(P) und NMN von e(P4) und NadN zu NR degradiert, nachdem NAD+ und NMN durch OmpP2 in das Periplasma gelangt sind. NR wird schließlich, als einziges Substrat, durch einen putativen Transporter in das Zytoplasma aufgenommen. In dieser Arbeit wurde der putative NR-Transporter als das hypothetische Gen HI1077.1 im Genom von H. influenzae identifiziert, welches nur 13,8% Identität zu Escherichia coli pnuC und 43,6% Identität zu P. multocida pnuC aufwies. Es konnten zwei Sequenzierungsfehler im original-annotierten Genom von H. influenzae gefunden werden, die zu einer Leserasterverschiebung geführt haben. HI1077.1 wurde zu pnuCHi reannotiert und weist nun eine 19,7% Identität zu pnuCEc und 71,4% Identität zu pnuCPm auf. Es wurde eine HI1077.1 Mutante konstruiert, die ein Wachstumsdefizit auf BHI-Platten bis zu einer NAD+-Konzentration von 15 mM bzw. unterhalb einer NR-Konzentration von 0,1 mM zeigte. Im Transport-Assay transportierte die HI1077.1 Mutante nur noch etwa 1% des eingesetzten NAD+- bzw. NR-Labels. Im Rattenversuch konnte gezeigt werden, dass das in vitro nicht essentielle pnuC in vivo sehr wohl essentiell ist. Die HI1077.1 Mutante verursachte, im Gegensatz zum Wildtyp und zur pnuC-Komplementante keine Bakteriämie mehr. Bei einer Komplementation mit NadV, kodierend für eine Nikotinamid-Phosphoribosyltransferase von H. ducreyi, wurde ebenfalls eine mit dem Wildtyp vergleichende Bakteriämie verursacht. Da bisher noch keine H. influenzae Isolate bekannt sind, die nadV besitzen, würde sich der hier identifizierte NR-Transporter von H. influenzae gut als antimikrobielles Ziel eignen. Die Protein-Topologie von PnuC wurde hinsichtlich der Membranlokalisation analysiert und PnuC konnte als ein Transmembranprotein bestätigt werden, das in der cytosolischen Membran lokalisiert ist. Durch PhoA und LacZ Analysen konnte die Topologie von PnuC aufgeklärt werden. Demnach besitzt PnuC acht Transmembrandomänen (TMD), wobei die N- und C-Termini im Cytosol lokalisiert sind. Die Analyse der strukturellen Funktion ergab, dass PnuC nur eine Unterbrechung der sechs letzten C-terminalen Aminosäuren (AS) toleriert, während die Proteinfunktion durch einen fusionierten C- und N-terminaler His-Tag nur mäsig beeinflusst wird. Des Weiteren wurde die Substratspezifität von PnuC untersucht. Dabei zeigte sich, dass der lange geglaubte NMN-Transporter von E. coli ebenfalls als NR-Transporter fungiert. Die Substratspezifität wurde auch bei A. actinomycetemcomitans und P. multocida untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass A. actinomycetemcomitans und P. multocida ebenfalls als einziges Substrat NR transportieren können, aber im Gegensatz zu H. influenzae NAD+ und NMN nicht als NR-Quellen verwerten können, was wahrscheinlich auf das Fehlen von e(P4) und NadN zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Gen HI0308 untersucht. Um dem Aspekt der Energetisierung des PnuC-Transporters näher zu kommen, sind die Gencluster HI1078-HI1080 und HI0164-HI0171 in die Untersuchung mit einbezogen worden. Die Na+-NQR-Oxidoreduktase wurde im Hinblick ihrer Dehydrogenase-Aktivität genauer charakterisiert. Die Suche nach möglichen Inhibitoren von PnuC führte zu 3-Aminopyridin-Analoga. Durch eine Mutantenanalyse konnte gezeigt werden, dass 3-AADP, 3-AAD und 3-AmPR der selben Aufnahmeroute folgen wie NADP+, NAD+ und NR, und via PnuC in die Zelle aufgenommen werden. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass NadR aus 3-AmPR und ATP das 3-AAD synthetisiert, welches als kompetitiver Inhibitor mit NAD+ in den zellulären Redoxreaktionen konkurriert und dadurch den Stoffwechsel hemmt. Des Weiteren wurden mehrere spontan 3-Aminopyridin-resistente H. influenzae Mutanten isoliert. / Haemophilus influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium of the family of Pasteurellaceae. A physiological characteristic of H. influenzae is its essential but deficient hemin and NAD+ biosynthesis. While hemin is required for aerobic growth, NAD+ is essential for anaerobic and aerobic growth. As a NAD+ dependent organism H. influenzae lacks the enzymes for NAD+ biosynthesis and that is why it can only incorporate a limited number of precursor molecules, such as NAD+(P), NMN, and NR. Other NAD+-independent Pasteurellaceae such as Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida und Actinobacillus actinomycetemcomitans can grow on NAm, additionally to NR. Hence, the investigation of the NAD+ uptake system harbors some potential to be utilized for the development of antimicrobial therapeutics. Our laboratory has clarified the NAD+ uptake route; NAD+(P) and NMN are degraded by e(P4) and NadN to NR, after NAD+ and NMN reached the periplasm through OmpP2. Finally, NR is taken up in the cytoplasm through a putative transporter. In this study, the putative NR transporter was identified as the hypothetical gene HI1077.1 in the genome of H. influenzae, which showed only 13,8% identity to the pnuC of Escherichia coli and 43,6% identity to the pnuC of Pasteurella multocida. Two sequencing errors were found within the pnuC encoding region in the original annotated genome of H. influenzae, which produced frame shifts. After sequence correction HI1077.1 was re-annotated to pnuCHi now showing 19,7% identity to the pnuC of E. coli, and 71,4% identity to the pnuC of P. multocida. A knock-out mutation was constructed for HI1077.1, which showed a growth deficiency on BHI-plates, if supplemented with NAD+ on concentrations below 15 mM, and NR concentrations below 0,1 mM. In transport assay the HI1077.1 mutant only transported 1% of the provided NAD+ and NR label, respectively. In the rat model it could be shown that the pnuC knock-out mutation was essential. There in respect to bacterial growth in the animal model, the HI1077.1 mutant was not able to cause a bacteremia in contrast to the wild type and the pnuC-complemented mutant. When the mutant was complemented with nadV, encoding a nicotinamide phosphoribosyltransferase of H. ducreyi, bacteremia was maintained that was comparable with the one produced by the wild type. Since, so far there are no H. influenzae isolates known, which carry the nadV gene, hence the NR transporter serves for essential gene function and could be further investigated as a potential antimicrobial target. The topology of PnuC was also analysed. The localisation of PnuC was confirmed at the cytosolic membrane. The membrane topology of PnuC was resolved with the investigation of PhoA and LacZ insertion analysis. According to this, PnuC possesses eight transmembrane domains (TMD) with the N-and C-termini localized within the cytosole. The research of the structural function indicates that PnuC tolerates a truncation of the last six C-terminal amino acids, while the function of the protein was only moderately affected by fusions of a C- or N-terminal His-Tags. In addition, the substrate specificity of PnuC was investigated. Thereby, it was demonstrated that the NMN transporter in E. coli in fact acts as an NR transporter. The substrate specificity of A. pleuropneumoniae and P. multocida was also under examination. It was established that A. pleuropneumoniae and P. multocida can transport NR as the unique substrate. However, NAD+ and NMN could not serve as Substrats to deliver NR, raising the question, whether e(P4) or/and NadN function is present in these bacteria. Additionally, in this study the gene HI0308 was investigated. To approach the aspect of energizing the PnuC transporter and the residual low affinity NR uptake the gene cluster HI1078-HI1080 and HI0164-HI0171 were characterised. The Na+-NQR oxidoreductase was more precisely characterised with regard to the activity of the dehydrogenase. The search for putative inhibitors of PnuC yielded in the analysis of 3-aminopyridine analogs. In this work it was demonstrated, that 3-AADP, 3-AAD and 3-AmPR follow the same uptake route as NADP+, NAD+ and NR, and are taken up via PnuC into the cell. Furthermore, we were able to show that 3-AAD can be synthesized from 3-AmPR and ATP. 3-AAD most likely competes versus NAD+ in metabolic relevant redox reactions and thereby inhibits the biosynthesis rate of the cells. In addition, several 3-aminopyridin resistant H. influenzae mutants were isolated.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1890 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Sauer, Elizabeta |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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