The fibulin family comprises eight extracellular matrix proteins associated with elastic fibers and basement membranes. Elastic fibers provide necessary tissue recoil to organs, including large arteries, lung, and skin, and elastogenesis requires the coordinated effort of many proteins. Knockout mouse studies have implicated fibulin-3, -4, and -5 (collectively referred to as the short fibulins), in elastic fiber assembly, stabilization, and function.Recombinant human full-length short fibulins were expressed in human embryonic kidney cells, and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. All three members consistently appear as multiple bands on protein gels. N-terminal protein sequencing revealed that all three proteins are readily cleaved within the atypical N-terminal linker region of the first calcium-binding epidermal growth factor domain. This multiple band pattern is also in part caused by the N-glycosylation and multimerization of the short fibulins. A similar band pattern was produced by incubation of the short fibulins with select matrix metalloproteinases. Fibulin-3 proteolysis was almost completely inhibited in cell culture with doxycycline (a broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor) supplementation.Human skin fibroblasts adhered strongly to the short fibulins, as measured by crystal violet attachment assays. Human lung fibroblasts and human umbilical vein and artery smooth muscle cells adhered slightly less. Calcium-dependent binding of the short fibulins to immobilized heparin in solid phase binding assays suggests that these fibulins may bind cell-surface heparan sulfate. / La famille de protéines fibuline est composée de huit membres, se situant dans la matrice extracellulaire, associée aux fibres élastiques et aux membranes basales. Les fibres élastiques confèrent l'élasticité requise aux organes, tels que les artères majeures, les poumons et la peau. La formation des fibres élastiques requiert la coordination de nombreuses protéines. Les souris knockout ont impliqué les fibulines courtes (fibuline-3, -4, et -5) dans la formation, la stabilisation, et le fonctionnement des fibres élastiques.Les fibulines courtes recombinantes ont été exprimées par les cellules HEK293 et purifiées par chromatographie d'affinité métallique. Les trois protéines migrent en plusieurs bandes sur les gels de SDS-PAGE. Le séquençage de l'extrémité N-terminale de ces bandes a démontré que les trois protéines sont coupées dans le linker du premier domaine de facteur de croissance épidermique lié au calcium. Cet effet de plusieurs bandes est en partie causé pas la N-glycosylation et la multimérisation des fibulines courtes. Un effet similaire se produit après l'incubation des fibulines courtes avec certaines métalloprotéinases matricielles. La protéolyse de fibuline-3 est presque complètement inhibée par l'addition de doxycycline (un inhibiteur de tous les métalloprotéinases matricielles) aux cellules HEK293.Les fibroblastes dermiques humains adhèrent fortement aux fibulines courtes, ce qui a été mesuré avec la coloration des cellules au cristal violet. Les fibroblastes pulmonaires humains et les cellules musculaires lisses de veine ombilicale et d'artère ombilicale adhèrent un peu moins fort. Les fibulines courtes interagissent aussi avec l'héparine immobilisée, en la présence de calcium. Ceci suggère que les fibulines courtes peuvent adhérer au sulfate d'héparane à la surface des cellules.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114359 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Djokic, Jelena |
| Contributors | Dieter Reinhardt (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Faculty of Dentistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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