ABSTRACTExtracellular matrix mineralization is a physiological process where hydroxyapatite is deposited onto collagenous matrix. Mineralization is initiated by an increase in phosphate concentration in the matrix and one major regulator of this process is alkaline phosphatase (TNAP). Absence of TNAP in hypophosphatasia patients and TNAP knockout mouse models significantly decreases matrix mineralization; however some mineral is deposited indicating that additional mechanisms exist to increase phosphate levels. In this study, we have used MC3T3-E1 osteoblast cultures to investigate ATP (adenosinetriphosphate) as a source of phosphate in osteoblast matrix mineralization. ATP hydrolysis by an ATPase enzyme can provide three phosphate ions. Osteoblasts also have receptors for ATP, ADP and AMP - latter two resulting from partial hydrolysis of ATP. To investigate ATP-mediated mineralization in osteoblasts, we used MC3T3-E1 preosteoblast cell line. Cells were cultured for 9 or 12 days and treated with ascorbic acid to induce collagen matrix formation and phosphate sources; β-glycerophosphate (βGP)(common source of phosphate in vitro), sodium monophosphate (SMP) and ATP. ATP added at level of 4mM resulted in mineral deposition, increased calcium and phosphate levels in the matrix and collagen deposition similar to that following conventional treatment with SMP and βGP. Non-hydrolyzable ATP analogue did not allow mineral deposition, demonstrating that mineralization directly coming from phosphate-ions of ATP. Other nucleotides, UTP and GTP also allowed mineral deposition, but were not as potent as ATP. When asking what enzyme could be responsible for ATP hydrolysis, it was noted that ATP treatment significantly downregulated TNAP. Downregulation was reversed by suramin, a P2 purinergic receptor (ATP and ADP receptor) antagonist, but was not affected by ATP receptor agonist indicating that the effect might arise from ADP receptor engagement. Furthermore, ATP-mediated mineralization was completely resistant to TNAP inhibition (by levamisole) indicating that ATP-mediated mineralization is mediated by another phosphate releasing enzyme(s). Interestingly, ATP-treatment increased general ATPase activity and the presence of a 64 kDa transglutaminase 2 (TG2) fragment in the culture medium. We have previously shown that a TG2 fragment in the extracellular space has increased ATPase activity. Treating the cultures with an extracellular ATPase inhibitor completely abolished not only ATP-, but also βGP- and SMP-induced mineralization, without affecting collagen deposition or cell density. This indicates that ATPase activity could contribute to general mineralization mechanisms, perhaps to initiation of the process. / ABRÉGÉLa minéralisation de la matrice extracellulaire est un processus physiologique qui consiste dans le dépôt des cristaux d'hydroxyapatite sur les fibres de collagène de la matrice extracellulaire. Le processus de minéralisation est initié par l'augmentation de la concentration des ions phosphate dans la matrice. Un facteur majeur de la régularisation des ions phosphates est la phosphatase alkaline (TNAP). L'absence du TNAP dans de patients atteints de l'hypophosphatasie se concrétise dans la diminution significative de la minéralisation de la matrice et ce a aussi été démontré par de modèles de souris knockout. Une certaine quantité de minéral en ayant été toutefois aussi déposée, indiquent que d'autre facteurs doivent exister en lien avec l'augmentation du niveau de phosphate. Dans cette étude nous avons utilisé des cultures de cellules ostéoblastes MC3T3-E1 pour investiguer l'adénosine-triphosphate (ATP) comme source de phosphate dans la minéralisation de la matrice des ostéoblastes. L'hydrolyse de l'ATP par une enzyme ATPase peut générer trois groupes phosphate. Les ostéoblastes possèdent aussi de récepteurs pour ATP, ADP et AMP - les deux derniers résultant par l'hydrolyse partielle de l'ATP. La croissance des ostéoblastes MC3T3-E1 a été faite pour 9-12 jours et les cellules ont été traités avec acide ascorbique (pour accélérer la formation de la matrice), β-glycerol phosphate (βGP) (source commune de phosphate dans les expérimentations in vitro), monophosphate de sodium (SMP) et l'ATP. L'adition d'ATP à une concentration de 4 mM induit le dépôt du minéral, l'augmentation du niveau de calcium et phosphate dans la matrice ainsi que le dépôt du collagène dans une manière similaire à celui observé pendant le traitement conventionnel avec βGP. En utilisant un agent analogue à l'ATP non-hydrolysé où le largage des ions phosphate est bloqué, le dépôt du minéral n'est plus observé, ce qui démontre que la minéralisation est directement induite par les ions phosphate d'ATP. D'autres nucléotides comme UTP et GTP aussi permettent le dépôt du minéral, mais à un niveau qui n'est pas aussi élevé que celui observé dans le cas de l'ATP. En se questionnant sur quelle enzyme pourrait être responsable pour l'hydrolyse de l'ATP, on note que le traitement avec ATP diminue significativement le TNAP. Au contraire, le TNAP augmente par le traitement avec suramin, un récepteur (d'ATP et d'ADP) purinérgique antagoniste P2, mais n'est pas affecté par le récepteur ATP agoniste, indiquant que l'effet pourrait être du au recepteur ADP. De plus, la minéralisation régulée par l'ATP s'est avérée résistante à l'inhibiteur TNAP levamisole, indiquant que la minéralisation en présence d'ATP doit être régulée par une autre enzyme libératrice de phosphate. A remarquer, le traitement ATP augmente l'activité générale d'ATPase en présence d'un fragment de 64 kDa de la transglutaminase 2 (TG2) dans le millieu de culture. Nous avons déjà montré qu'un fragment TG2 dans l'espace extracellulaire augment l'activité ATPase. Le traitement des cellules avec un inhibiteur ATPase extracellulaire bloque non seulement la minéralisation induit par l'ATP, mais aussi la minéralisation régulée par βGP et SMP sans toutefois altérer le dépôt du collagène ou la densité cellulaire. Ce résultat indique que l'activité ATPase pourrait contribuer aux mécanismes de minéralisation en général, au moins en jouant un rôle important à l'initiation du processus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117162 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Bensaud, Nabila |
| Contributors | Mari Tuulia Kaartinen (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Faculty of Dentistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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