The hepatitis C virus (HCV) is a positive-strand RNA virus that belongs to the Flaviviridae family. HCV expresses the non-structural protein, NS5B, an RNA-dependent RNA polymerase required for genome replication. Here, we describe the allosteric properties of both the GTP-specific binding site (G-site) of the HCV polymerase and VIR-1327, a benzimidazole-derivative non-nucleoside inhibitor (NNI). Using biochemical assays, we identified certain G-site residues that affect NS5B activity, including serine-29, proline-495 and valine-499. We also demonstrated that VIR-1327 is a potent inhibitor with a resistance profile consisting of P495A and V499A mutants, but is non-competitive with regards to GTP. Moreover, biophysical results suggest that the mechanism of action of VIR-1327 is to prevent the formation of a stable enzyme-template complex. Further analysis of the G-site and NNIs will not only provide a better understanding of HCV replication, but also validate different allosteric sites as virus-specific targets for the development of anti-HCV therapeutics. / Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus d’ARN de polarité positive qui appartient à la famille Flaviviridae. Le VHC exprime la protéine non-structurelle NS5B, une ARN polymérase dépendante de l’ARN indispensable à la réplication du génome virale. Nous décrivons ici les propriétés allostériques du site GTP-spécifique (site-G) du VHC polymérase, ainsi que les propriétés allostériques de VIR-1327, un inhibiteur non-nucléoside (INN) qui est dérivé du benzimidazole. En utilisant des tests biochimiques, nous avons identifié certains résidus du site-G qui influencent l’activité du NS5B, incluant sérine-29, proline-495 et valine-499. Nous avons également démontré que VIR-1327 est un puissant inhibiteur avec un profil de résistance comprenant les mutants P495A et V499A, mais qu’il est non-compétitif avec le GTP. De plus, des résultats biophysiques suggèrent que le méchanisme d’action de VIR-1327 est de prévenir la formation d’un complexe enzyme-matrice stable. D’autres analyses du site-G et des INN vont non seulement fournir une meilleure compréhension de la réplication du VHC, mais aussi valider différents sites allostériques comme étant des cibles virus-spécifiques pour le développement de thérapeutiques contre le VHC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.40750 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Vasquez, Colins |
| Contributors | Matthias Gotte (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Microbiology & Immunology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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