The efficacy of bone marrow transplantation is critically dependent on the transfer of sufficient hematopoietic stem cells (HSCs) which possess the capacity for self-renewal and can fully reconstitute the hematopoietic system. By transiently manipulating the factors that govern HSC homeostasis it has been proposed that HSCs can be expanded without the loss of essential stem cell characteristics. Previously it was observed that ablation of Gfi1b in-vivo using the interferon based Mx-Cre system results in a dramatic expansion and mobilization of hematopoietic stem cells in the bone marrow and periphery. I was able to replicate this finding using a non-inflammatory, tamoxifen inducible, deletion system indicating this expansion is a property of Gfi1b ablation and so it was hypothesized that Gfi1b regulates the fate of HSCs and is a potential target for their ex-vivo expansion. Indeed, when deletion of Gfi1b was induced in whole bone marrow ex-vivo HSCs expanded both in absolute number and in terms of proportion of bone marrow by approximately 5-fold. Furthermore, in ex-vivo¬ expansion cultures of primary HSCs tracking of surface levels of cd48, which indicates an HSC has transitioned to a differentiation committed multi-potent progenitor, revealed that Gfi1b null HSCs underwent symmetric self-renewal type cell divisions at a significantly increased frequency. Importantly it has also been shown that HSCs lacking Gfi1b cycle at a faster rate than control HSCs. This combination of increased cell division and preferential self-renewal of Gfi1b-/- HSCs indicates that inhibition of Gfi1b is an ideal strategy for ex-vivo HSC expansion. As well, in accordance with this preference for self-renewal, Gfi1b null HSCs that were cultured under myeloid differentiation conditions remained primarily in an undifferentiated state as defined by a lack of the myeloid surface markers Gr1 and Mac1. These cultures also demonstrated increased long term colony forming capacity versus controls, further supporting an undifferentiated phenotype in Gfi1b-/- cells.Because the stem cell niche is a highly complex and heterogeneous environment I also investigated whether bone marrow in which Gfi1b has been deleted exerts paracrine effects that contributed to HSC expansion. Co-Culture assays demonstrated that Gfi1b-/- bone marrow was able to induce an expansion of progenitors in wild-type bone marrow of more than 10 fold compared to Gfi1b-/+ bone marrow. Interestingly cells co-cultured with Gfi1b null bone marrow also exhibited an overall proliferation advantage of approximately 3 fold after short-term cultures. This indicates that not only does loss of Gfi1b induce HSC expansion via cell intrinsic mechanisms, but also through paracrine factors that alter the bone marrow homeostasis. I also investigated the role of Gfi1b in HSC associated malignancies. Previously it had been described that Gfi1b is overexpressed in BCR-ABL driven CML and B-ALL. As well work from our lab showed that transgenic overexpression of Gfi1b in model B-ALL accelerate disease progression and morbidity. I was able to show that deletion of Gfi1b in an established B-ALL leads to remission of disease. As well pharmacological inhibition of the core Gfi1b co-factor LSD1 was shown to kill CML cells in-vitro proportionally to concentration. This suggests that Gfi1b plays a central functional role in both normal and malignant hematopoietic cells. / L'efficacité d'une greffe de moelle osseuse dépend de façon critique du transfert d'un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques (CSHs) qui possèdent 1- la capacité de s'auto-renouveler et 2- la capacité d'entièrement reconstituer le système hématopoïétique suite à leur différentiation. En manipulant transitoirement les facteurs qui régissent l'homéostasie des CSHs, il a été proposé qu'une expansion de ces dernières peut être réalisée sans entraîner la perte de leurs caractéristiques essentielles. Il avait préalablement été observé que l'ablation de l'expression de Gfi1b in vivo, grâce au système Mx-Cre basé sur l'interféron, entraînait une expansion et une mobilisation spectaculaires du nombre de CSHs dans la moelle osseuse et la périphérie. J'ai pu reproduire ce résultat en utilisant un système de suppression de l'expression de Gfi1 inductible au tamoxifen et non-inflammatoire, suggérant que l'expansion du nombre de CSHs observée est bien une propriété de l'ablation de l'expression de Gfi1b. Nous avons par conséquent émis l'hypothèse que Gfi1b régie le sort des CSHs et est une cible potentielle pour leur expansion ex-vivo. En accord avec cette hypothèse, nous avons observé une expansion d'environ 5 fois du nombre de CSHs en nombre absolu et en termes de proportion de la moelle osseuse lorsque la délétion de l'expression de Gfi1b est induite dans l'ensemble des cellules de moelle osseuse ex-vivo. De plus, le suivi des niveaux d'expression dans les cultures d'expansion de CSHs du marqueur de surface CD48, qui indique qu'une CSH s'est différentiée en progéniteur multipotent, a permis de révéler que les CSHs Gfi1b-nulles se sont divisées de façon symétrique en conservant leur capacité d'auto-renouvellement avec une fréquence significativement plus élevée que les cellules contrôles. Il a également été démontré que les CSHs Gfi1b-nulle se divisent à un rythme plus élevé. Cette combinaison de l'augmentation de la division cellulaire et de l'auto-renouvellement des CSHs Gfi1b-/- indique que l'inhibition de Gfi1b est une stratégie idéale pour l'expansion des CSHs ex-vivo. Conformément à cette préférence pour l'auto-renouvellement, les CSHs Gfib-nulles qui ont été cultivées dans des conditions de différenciation myéloïde sont restées principalement dans un état indifférencié tel que défini par l'absence de marqueurs de surface myéloïdes Gr1 et MAC1. Ces cultures ont également démontré une augmentation de leur capacité à former des colonies à long terme en comparaison des contrôles. Ces résultats soutiennent le phénotype non différencié des cellules Gfi1b-/-. J'ai également étudié le rôle de Gfi1b dans les tumeurs malignes associées aux CSHs. Auparavant, il avait été décrit que l'expression de Gfi1b est augmentée dans les CML et les B-ALL induites par BCR-ABL. De plus, des études provenant de notre laboratoire ont montré que la surexpression de Gfi1b dans un modèle de B-ALL accélère la progression de la maladie et de la morbidité. En contraste, j'ai pu démontrer que la suppression de l'expression de Gfi1b dans un modèle établi de B-ALL entraîne une rémission de la maladie. De plus, l'inhibition pharmacologique de LSD1, un cofacteur de Gfi1b, entraîne la mort des cellules leucémiques in vitro proportionnellement à sa concentration. Ces études suggèrent que Gfi1b joue un rôle fonctionnel central dans les cellules hématopoïétiques normales et malignes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.121311 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Krongold, Joseph |
| Contributors | Tarik Möröy (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses |
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