Beta2-adrenergic receptors (beta2ARs) are predominantly expressed in cardiomyocytes and regulate cardiac contractility. Prolonged stimulation of these receptors can cause detrimental as well as beneficial effects during heart failure. The ability to transduce these different signals is thought to occur via their association into specific multiprotein complexes containing specific set of heterotrimeric G proteins, effectors, and several other interacting partners that modulate their biosynthesis, signalling, and trafficking. The initial interaction of components comprising these signalling complexes occurs at the level of the endoplasmic reticulum (ER) and at present many of the proteins and processes mediating their assembly remain unknown. In order to identify these proteins and candidate processes, we developed a novel proteomic approach for beta2AR purification. We validated this approach by detecting several known interacting partners of beta2AR in HEK 293 cells including adenylyl cyclase 3, N-ethylmaleimide-sensitive factor, ubiquitin, Na+/H+ exchanger regulatory factor 2 (NHERF2) and of course heterotrimeric G proteins. In addition, we identified and confirmed VCP, gp78 and RNF5, proteins related to ER-associated degradation (ERAD), as novel interacting partners of beta2AR. We demonstrated that VCP retrotranslocates beta2AR from ER to the cytosol and the receptor is degraded by the cytosolic proteasome. Proteasome inhibition or VCP knockdown decreased receptor interaction with Gbetagamma and led to an enhanced signalling response via ERK1/2. We conclude that ERAD specifically regulates levels of uncomplexed beta2ARs to Gbetagamma thus has a previously uncharacterized role in quality control of signalling complex assembly. A better understanding of this process might lead to novel therapeutic strategies during clinical conditions such as heart failure where the nature of receptor signalling complexes changes dramatically. / Les récepteurs beta2-adrénergiques (beta2ARs) sont exprimés majoritairement dans les cardiomyocytes et régulent la contractilité myocardique. Lors d'insuffisance cardiaque congestive, la stimulation prolongée de ces récepteurs peut provoquer des effets bénéfiques mais aussi néfastes. Il est suggéré que les réponses aux différents signaux surviennent suite à l'assemblage de ces récepteurs dans des complexes multiprotéiques. Ces derniers sont composés d'ensembles spécifiques de protéines G hétérotrimériques, d'effecteurs et de plusieurs autres partenaires d'interaction, qui modulent la biosynthèse, la signalisation et l'acheminement membranaire du récepteur. Le premier site d'interaction de ces composants s'effectue au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Actuellement, les protéines et les processus de médiation de cet assemblage restent inconnus.Afin d'identifier ces protéines et ces processus de médiation, nous avons développé une nouvelle approche protéomique suivant la purification du beta2AR. Nous avons validé notre approche en détectant plusieurs partenaires d'interaction connus du beta2AR dans des cellules HEK 293, tels que l'adénylate cyclase 3, la protein sensible de fusion de N-ethylmaleimide (NSF), l'ubiquitine, Na+/H+ exchanger regulatory factor 2 (NHERF2) et bien sûr les protéines G hétérotrimériques. De plus, nous avons identifié de nouveaux partenaires d'interaction du beta2AR tels que VCP, gp78 et RNF5, des protéines du système de dégradation associé au RE (ERAD). Nous avons démontré que VCP extrait le beta2AR du RE pour le diriger vers le cytosol afin d'être subséquemment dégradé par le protéasome. L'inhibition du protéasome et la suppression du VCP par l'utilisation de siRNA ont diminué l'interaction du récepteur avec les protéines G et ont augmenté la signalisation du récepteur via la voie ERK1/2. Nous concluons que le beta2AR non complexé aux protéines Gbetagamma est régulé spécifiquement par l'ERAD, ce qui suggère un rôle nouveau pour ERAD dans le contrôle de l'assemblage du complexe de signalisation. Une meilleure compréhension de ce processus pourrait mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisées dans des situations cliniques comme l'insuffisance cardiaque congestive, où la nature de la signalisation du récepteur peut changer dramatiquement.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.107784 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Glazkova, Irina |
| Contributors | Terence Hebert (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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