In utero exposure to teratogenic drugs and environmental chemicals can cause various developmental defects. However, the mechanism underlying these malformations is not well understood. Exposure to ethylene glycol monomethyl ether (EGME), a glycol ether compound found in numerous industrial products, or to its active metabolite, 2-methoxyacetic acid (2-MAA), increases the incidence of developmental defects, including limb malformations. My goal was to test the hypothesis that the adverse effects of EGME on limb development are mediated by 2-MAA-induced alterations in the acetylation programming by using an in vitro murine limb bud culture system. Forelimbs from CD-1 gestation day 12 mouse embryos were excised and cultured with vehicle or increasing concentrations (3 mM, 10 mM and 30 mM) of EGME or 2-MAA. Limb differentiation was scored using a morphogenetic scoring system on day 6 of culture. Limbs were collected after 1, 3, 6, and 24 hours of exposure to assess the effects of EGME and 2-MAA on the acetylation of histones (H3K9 and H4K12) and a non-histone protein, p53 (p53K379). To better understand the mechanism of action, gene expression profiling was also conducted on 2-MAA-treated limbs (3 mM) after 3 h exposure. Furthermore, the effects of EGME and 2-MAA were assessed on downstream biomarkers of cell cycle arrest (p21 expression) and apoptosis (cleaved caspase-3). EGME exposure had only minimal effects on limb development, whereas 2-MAA caused a concentration-dependent increase in limb malformations. Therefore, 2-MAA mediates the teratogenicity of EGME and has a substantial impact on limb development. EGME had no effects on the acetylation of histones or a non-histone protein, p53. However, a significant hyperacetylation of H9K9, H4K12 and p53K379 was observed in 2-MAA–treated limbs. Gene expression analysis of 2-MAA (3 mM) exposed limbs at 3 h revealed that 2-MAA-treated limbs have a completely different profile than control limbs. EGME had no effects on markers of cell cycle arrest or apoptosis, whereas 2-MAA caused a significant increase in the expression of p21 and in the cleavage of caspase-3. Furthermore, the hyperacetylation of p53K379 was correlated with a significant increase in p21 expression, and cleaved caspase-3, both in terms of concentration and timing. These data suggest that 2-MAA-induced disruption of limb development in vitro is associated with a dysregulation of acetylation and gene expression as early as 3 h after exposure. Therefore, I propose that modifications in acetylation programming underlie the teratogenicity of 2-MAA. / Une exposition à des médicaments tératogènes ou à des produits chimiques environnementaux au cours du développement embryonnaire peut causer divers malformations congénitales. Pourtant, le mécanisme qui sous-tend ces malformations n'est pas bien comprit. Une exposition à l'éthylène glycol éther monométhylique (EGME), un éther de glycol trouvé dans de nombreux produits industriels, ou à son métabolite actif, l'acide 2-méthoxyacétique (2-MAA), augmente l'incidence des malformations congénitales, y compris les malformations des membres. Mon objectif était de tester l'hypothèse que les effets néfastes d'EGME sur le développement des membres sont médités par les altérations que 2-MAA induit dans la programmation d'acétylation en utilisant un système de culture membre in vitro. Les membres antérieurs de souris CD -1 âgés de 12 jours de gestation ont été excisés et mis en culture avec un véhicule ou des concentrations croissantes (3 mM, 10 mM et 30 mM) de EGME ou 2-MAA. La différenciation des membres a été établie à l'aide d'un système de notation morphogénétique après 6 jours en culture. Les membres ont été recueillis après 1, 3, 6, et 24 heures d'exposition pour évaluer les effets d'EGME et 2-MAA sur acétylation des histones (H3K9 et H4K12) et la protéine non- histone, p53 (p53K379). Pour mieux comprendre le mécanisme d'action, l'analyse d'expression génique a également été menée sur les membres traités pendant 3 heures avec 2-MAA (3 mM). Les effets d'EGME et 2-MAA ont également été évaluées sur des marqueurs biologiques de l'arrêt du cycle cellulaire (expression de p21) et de l'apoptose (caspase-3 clivée).L'exposition à EGME n'avait que des effets minimes sur le développement des membres, alors que 2-MAA a provoqué une augmentation de malformations aux membres qui étaient dépendante sur la concentration. Donc, 2-MAA médie la tératogénicité d'EGME et a un impact néfaste considérable sur le développement des membres. EGME eu aucun effet sur les marqueurs d'acétylation histones et non-histone (p53). Cependant, un hyperacétylation importante a été observée dans H9K9, H4K12 et p53K379 dans les membres traités par 2-MAA. L'analyse d'expression génique de 2-MAA (3 mM) après 3 heures, a révélé un profil d'expression génique complètement différent de celui du véhicule. EGME n'a eu aucun effet sur les marqueurs importants sur l'arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose, tandis que 2-MAA a provoqué une augmentation significative de l'expression de p21 et de la caspase- 3 clivée. En outre, la hyperacétylation de p53K379 a une forte corrélation à l'augmentation significative de l'expression de p21 et la caspase-3 clivée, à la fois en termes de concentration et de temps. Ces résultats suggèrent que la perturbation du développement des membres induit par 2-MAA in vitro est associée à une dérégulation de d'acétylation et d'expression génique aussi tôt que 3 heures après l'exposition. Je propose donc que des modifications dans la programmation d'acétylation sous-tendent la tératogénicité de 2-MAA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123044 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Dayan, Caroline |
| Contributors | Barbara F Hales (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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