Follicle-stimulating hormone (FSH) is a key regulator of mammalian reproduction. Activins, members of the TGFβ superfamily, selectively stimulate FSH synthesis via regulation of FSH β-subunit (Fshb) transcription. Forkhead box L2 (FOXL2) mediates activin induction of Fshb transcription in gonadotrope cells. We identified a conserved cis-element in the proximal Fshb promoter that binds FOXL2 with high affinity, which matches the consensus forkhead binding element characterized in other genes. In contrast, another study identified a different FOXL2 cis-element through screening of a random oligonucleotide library. Moreover, FOXL2 has been characterized as an important transcription factor in the regulation of other genes, including steroidogenic acute response (StAR), aromatase (CYP19), gonadotropin-releasing hormone receptor (Gnrhr), and follistatin (Fst). These data suggest that FOXL2 may exhibit flexibility in its DNA binding activity. To provide a clearer understanding of the mechanisms mediating FOXL2 binding to DNA, I aimed to solve the X-ray crystal structure of the murine FOXL2 forkhead domain in complex with its high affinity cis-element in the murine Fshb promoter. I expressed GST-tagged murine FOXL2 forkhead domain (amino acids 48-144), purified it from E.coli and examined its DNA binding activities using gel-shift assays and isothermal titration calorimetry (ITC). I also generated a homology model of FOXL2 bound to DNA, allowing me to identify crucial amino acids and nucleotides mediating binding. I optimized the conditions for protein purification using affinity, ion exchange, and size exclusion chromatography. We have obtained protein-DNA crystals that diffract X-rays to low-resolution and are currently screening to obtain better quality crystals. Ultimately, the results of our analysis will provide a structural description of FOXL2 binding to the Fshb promoter, and may provide insight into the basis for the apparent FOXL2 binding site flexibility. / L'hormone folliculo-stimulante (FSH) est un régulateur clé de la reproduction chez les mammifères. Les activines, membres de la superfamille TGFß, stimulent de manière sélective la synthèse de FSH en contrôlant la transcription de sa sous-unité β (Fshb). Dans les cellules gonadotropes de l'hypophyse, la protéine forkhead box L2 (FOXL2) est médiatrice de l'induction de la transcription de Fshb par les activines. Nous avons identifié un élément cis sur le promoteur proximal du gène Fshb qui lie FOXL2 avec haute affinité ; celui-ci correspond à l'élément consensus de liaison forkhead typique caractérisé dans d'autres gènes de la même famille. En revanche, une autre étude a identifié un élément cis différent pour FOXL2 suite à un dépistage d'une bibliothèque oligonucléotides aléatoires. De plus, FOXL2 a été caractérisée comme un facteur de transcription important dans la régulation d'autres gènes, y compris la steroidogenenic acute regulatory factor (StAR), l'aromatase (CYP19), le récepteur de l'hormone libérant la gonadotropine (Gnrhr), et follistatine (Fst). Ces données suggèrent que FOXL2 peut présenter une flexibilité dans la compostion de l'élément de liaison à l'ADN. Afin d'obtenir une meilleure compréhension des mécanismes qui explique la liaison de FOXL2 à l'ADN, j'ai cherché à résoudre la structure cristalline aux rayons X de du domaine forkhead de FOXL2 en complexe avec son élément cis de haute affinité sur le promoteur murin de Fshb. J'ai exprimé le domaine forkhead de la protéine murine de FOXL2 en fusion avec GST (acides aminés 48-144). Je l'ai ensuite purifiée à partir de bactérie E. coli et j'ai examiné sa capacité de lier d'ADN en utilisant des essais de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) ainsi que la calorimétrie isotherme de titration (ITC). J'ai aussi créé un modèle par homologie de FOXL2 lié à l'ADN, ce qui nous a permis d'identifier les acides aminés et les nucléotides critiques impliqués dans cette liaison entre domaine forkhead et ADN. J'ai optimisé les conditions de purification de la protéine recombinante de FOXL2 à l'aide de colonnes basées sur l'affinité, l'échange d'ions ainsi que de la chromatographie d'exclusion stérique. Nous avons obtenu des cristaux protéine-ADN qui ont effectivement diffracté les rayons X à basse résolution et somme actuellement à l'étape d'optimisation afin d'obtenir des cristaux de meilleure qualité. Finalement, les résultats de notre analyse constitue une base solide dans la quête de la structure de FOXL2 lié au promoteur Fshb et nous éclairera dans notre compréhension de l'apparente flexibilité de FOXL2 envers son site de liaison sur l'ADN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.110481 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Libasci, Vanessa |
| Contributors | Daniel Bernard (Internal/Supervisor), Gregory Miller (Internal/Cosupervisor2) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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