CD45 phosphatase is expressed ubiquitously on cells of lymphoid origin, and has long been considered a drug target for immunosuppression. CD45 is a key component of the signaling pathway in immune cells, regulating activation and development of these cells. Drug intervention could suppress growth and provide a therapeutic avenue for treatment of transplant rejection, auto-immune diseases such as rheumatoid arthritis, and various cancers of the immune system. The intracellular, catalytic portion of CD45 is comprised of the D1 and D2 domains. The active site is located in the D1 domain, and the D2 domain is catalytically inactive. We decided to target the inter-domain region between D1 and D2 for the development of a small molecule allosteric inhibitor. The linker region between CD45 D1 and D2 was modeled in silico, and NCI database was screened for compounds that dock in this region. Hits were tested in vitro and we detected two CD45 inhibitors, one of which was demonstrated to be highly selective for CD45 in tyrosine phosphatase counter-assays. Analogs were generated which increased in vitro potency, and cell membrane permeability. The most active inhibitor, 211, was pursued further. The kinetics of CD45 inhibition by 211 indicated a non-competitive and irreversible mechanism of action, as well as some degree of substrate specificity. Site-directed mutations in CD45 enzyme at the predicted 211 binding sites revealed a loss of inhibition by 211 in the mutant CD45, consistent with the in silico prediction of allosteric inhibition. Circular dichroism studies indicated a conformational change in CD45 enzyme, in the presence of 211. We first validated that CD45 was the target of 211 in cells, by evidence of a change in the phosphorylation of its in vivo substrate Lck in Jurkat cells. As a control, the phosphorylation status of Lck was not affected in J45.01 (CD45-negative) cells with 211 treatment. 211 was shown to suppress the activation of T cell receptor signaling in primary T cells. In vivo, 211 inhibits the antigen-induced immune response in the mouse footpad.CD45 inhibitor 211 was assayed for its anti-cancer properties in the EL4 mouse thymoma cell line. 211 inflicted dose-dependent toxicity on these cells via cell cycle rest and apoptosis. EL4 cells injected into mice were delayed in developing a solid tumor when mice were treated with 211, and metastasis to the lymph nodes was reduced in these animals. Our work has shown the therapeutic potential of targeting CD45 by revealing a novel allosteric binding site for a CD45 inhibitor, and this approach may be useful for targeting other two-domain tyrosine phosphatases. / La phosphatase CD45 est exprimée de manière ubiquitaire dans les cellules d'origine lymphoïde, et a longtemps été considérée comme une cible thérapeutique pour l'immunosuppression. CD45 est une composante clé de la voie de signalisation dans les cellules immunitaires, dans la régulation de l'activation et dans le développement de ces cellules. L'intervention médicale pourrait bloquer la croissance et fournir une avenue thérapeutique pour le traitement du rejet de greffe, les maladies auto-immunes telle que la polyarthrite rhumatoïde, et de divers cancers du système immunitaire. La partie intracellulaire catalytique de CD45 comprend les domaines D1 et D2. Le site actif est situé dans le domaine D1, et D2 est le domaine catalytiquement inactif. Nous avons décidé de cibler la région inter-domaine entre D1 et D2 pour développer des possibles inhibiteurs allostériques de petit poids moléculaires. La région de liaison entre CD45 D1 et D2 a été modélisée in silico. Nous avons d'abord analysé une base de données NCI pour des composés qui s'amarrent dans cette région. Puis, nous avons testé in vitro plusieurs composés obtenus, et nous avons détecté deux inhibiteurs de CD45, dont l'un a été démontré pour être très sélectif pour CD45 dans des contre-essais avec autres phosphatases tyrosine. Des analogues ont été produit, et ceux-ci avaient une plus grande puissance in vitro et une meilleure perméabilité de la membrane cellulaire. L'inhibiteur le plus actif, 211, a été poursuivi comme tête de série.La cinétique de l'inhibition de CD45 par 211 indique un mécanisme d'action non compétitif et irréversible, ainsi qu'un certain degré de spécificité de substrat. Des mutations du CD45 sur les sites de liaisons du 211 ont montré une perte de l'inhibition du 211 sur le CD45 mutant, confirmant ainsi les résultats obtenus par l'inhibition allostérique in silico. Des études de dichroïsme circulaire ont indiqué un changement de conformation de l'enzyme CD45, en présence de 211. Nous avons d'abord validé que CD45 est la cible de 211 dans les cellules, par des preuves d'un changement de phosphorylation Lck dans les cellules Jurkat, mais pas J45.01 (CD45 négatives), avec traitement de 211. Nous avons montré que 211 est capable d'inhiber l'activation de signalisation induite par l'anticorps de récepteur cellule T dans les cellules T primaires, et témoignent d'une inhibition de la réponse immunitaire dans le coussinet plantaire du souris.L'inhibiteur de CD45 211 a été testé pour ses propriétés anti-cancer dans la lignée de cellules du thymus du souris EL4. Une toxicité dose-dépendante induite par 211 a été jugée de nature apoptotique, et déclenché par un arrêt du cycle cellulaire après 16 heures de traitement. Des cellules EL4 injectées dans des souris ont été retardés dans le développement d'une tumeur solide lorsque les souris ont été traitées avec 211, et des métastases dans les ganglions lymphatiques ont été réduites chez ces animaux.Nos travaux ont révélé un nouveau site de liaison d'un inhibiteur de CD45, et cette approche peut être utile pour cibler d'autres tyrosine phosphatases de deux domaines. Nous avons également affiché le potentiel thérapeutique du ciblage CD45 allostérique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119410 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Perron, Michael |
| Contributors | Horacio Saragovi (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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