Hydroxyurea is commonly used to treat myeloproliferative diseases and sickle cell anemia. It is also a potent teratogen, inducing severe developmental malformations in many animal models after in utero exposure. The administration of hydroxyurea to CD1 mice during organogenesis causes predominantly hindlimb, tail, and neural tube defects. Hydroxyurea inactivates ribonucleotide reductase, inhibiting DNA replication and leading to DNA replication stress and cell death. Hydroxyurea exposure during embryo development also induces oxidative stress and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) signaling. My goal was to test the hypothesis that hydroxyurea-induced p38 MAPK activation, DNA damage, and cell death are spatially related to the malformations observed in organogenesis-stage embryos.Hydroxyurea (400 or 600 mg/kg) or saline was given intraperitoneally to CD1 mice on gestation day 9. Dams were euthanized and whole embryos collected at 0.5, 3 and 6 hours post-treatment. Whole embryo protein extracts were used to examine the protein expression and activation levels of the p38 MAPK pathway using Western blots. Five regions of the embryos, including the rostral and caudal neuroepithelium, neural tube, somites and heart, were selected to determine the localization of proteins and DNA damage, using immunofluorescence and confocal microscopy. Subsequently, quantification of protein expression and DNA damage in the embryo at the subcellular level was determined using 3D imaging software. Hydroxyurea treatment (400 or 600 mg/kg) induced the activation of mitogen-activated protein kinase kinases 3/6 (MEK-3/6), upstream MAP2K3 kinases; phospho-MEK-3/6 immunoreactivity was widespread throughout the embryo after hydroxyurea exposure. Downstream phospho-p38 MAPK was increased in the rostral and caudal neuroepithelium and the neural tube, but not in the somites or heart. Nuclear translocation of phospho-p38 MAPK was significantly elevated in the rostral and caudal regions of embryos 3 hours after hydroxyurea treatment. Hydroxyurea exposure increased DNA damage, as assessed by the formation of γ-H2AX foci, throughout the embryo; the volume of γH2AX foci peaked in the caudal neuroepithelium 3 hours post-treatment with hydroxyurea. Pyknotic nuclei and cell fragmentation increased 3 and 6 hours following hydroxyurea exposure in all regions of the embryo except the heart. These data suggest that the p38 MAPK nuclear signaling and DNA damage response triggered by hydroxyurea exposure play key roles in mediating the caudal malformations that are observed. Further work is needed to evaluate these two stress response pathways in order to elucidate the mechanism of embryonic responses to a teratogenic insult. / L'hydroxyurée est un médicament couramment utilisé pour traiter les maladies myéloprolifératives et l'anémie falciforme. Il a cependant un puissant effet tératogène, causant de graves malformations congénitales chez de nombreux modèles animaux lorsqu'administré durant la grossesse. Le traitement de souris CD1 avec de l'hydroxyurée pendant la période de l'organogenèse provoque principalement des malformations au niveau des membres postérieurs, de la queue et des anomalies du tube neural. L'hydroxyurée inactive la ribonucléotide réductase ce qui diminue la réplication de l'ADN, et mène à la mort cellulaire. Une exposition à l'hydroxyurée au cours du développement embryonnaire induit également un stress oxydatif et active la voie de signalisation p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK p38). Mon objectif était de tester l'hypothèse selon laquelle les malformations observées suite à une exposition à l'hydroxyurée lors de l'organogénèse sont colocalisées avec une activation de MAPK p38, des dommages crées à l'ADN et une mort cellulaire.Au jour 9 de la gestation, des souris CD1 ont été injectées avec de l''hydroxyurée (400 ou 600 mg / kg) ou une solution saline par voie intrapéritonéale. Les mères ont été euthanasiés et les embryons prélevés à 0,5, 3 et 6 heures post-traitement. L'expression de protéines et des niveaux d'activation de la voie de signalisation MAPK p38 ont été quantifiée par par western blot réalisé sur des extraits protéiques entiers de l'embryon. Les protéines et les dommages crées à l'ADN ont été localisés par microscopie confocale et immunofluorescence dans cinq régions de l'embryon comprenant le neuroépithélium rostrale et caudale, le tube neural, les somites et le cœur. Leur localisation au niveau subcellulaire a ensuite été déterminée en utilisant un logiciel d'imagerie 3D.L'hydroxyurée (400 ou 600 mg / kg) induit l'activation des kinases activées par les mitogen-activated protein kinase kinase 3/6 (MEK-3/6) de la catégorie des MAP2K3 kinases; Les embryons provenant des groupes traités à l'hydroxyurée démontrent une immunoréactivité positive de phospho-MEK-3/6 détectée dans les cinq régions analysées de l'embryon. L'expression de phospho-p38 MAPK, la cible cellulaire de MEK-3/6, est élevée dans le neuroépithélium rostrale et caudale et le tube neural, mais pas dans les somites ou les cellules cardiaques. De plus, une translocation nucléaire de phospho-p38 MAPK est significativement induite dans les régions rostrales et caudales des embryons collectés 3 heures après le traitement à l'hydroxyurée. L'exposition à l'hydroxyurée est associée avec une augmentation des dommages crées à l'ADN, telle que démontrée par la formation de foyers de γH2AX dans les cinq régions étudiées de l'embryon. . Le nombre maximal de foyers γH2AX est observé dans le neuroépithélium caudale, 3 heures après l'exposition à l'hydroxyurée. Une augmentation du nombre de noyaux pycnotiques et de cellules avec une ADN fragmentée est détectée 3 à 6 heures après l'exposition à l'hydroxyurée dans toutes les régions de l'embryon à l'exception du cœur. Ces données suggèrent que l'activation de la voie de signalisation MAPK p38 nucléaire et les conséquences des dommages crées à l'ADN provoquées par une exposition à l'hydroxyurée jouent un rôle clé dans l'induction des malformations caudales observées. Des études supplémentaires sont néanmoins nécessaires afin d'investiguer ces deux voies de réponse au stress et ce, dans un but d'élucider les mécanismes de défenses embryonnaire face à un tératogène.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.117001 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Banh, Serena |
| Contributors | Barbara F Hales (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Pharmacology and Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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