Arsenic trioxide (ATO) is a successful treatment option for Acute Promyelocytic Leukemia (APL), but other cancers remain mildly sensitive to ATO at clinically achievable doses. Moreover, APL cells can develop resistance to ATO. It has been shown that resistance to ATO and/or moderate sensitivity correlates with either modulation of arsenic transport or increased expression of cytoprotective enzymes. Darinaparsin (S-dimethylarsino-GSH; Dar) is a significantly more potent apoptosis-inducing arsenical than ATO in various malignant cell lines and in APL patient blasts. It also has a maximum tolerated dose that is 35-fold higher than ATO. Interestingly, ATO-resistant APL cells are sensitive to Dar. Dar accumulates in the cell to a greater extent that ATO, which led us to the hypothesis that Dar import might also contribute to its enhanced efficacy. We show that both ATO and Dar induce the expression of the cystine importer xCT. We found that extracellular thiols inhibit Dar intracellular accumulation, as well as apoptosis. Thus, we hypothesized that thiols can prevent Dar import. GSH itself is not imported in the cell, so we thought it unlikely that Dar would enter the cell without being somehow modified. Structural analysis of Dar reveals putative break-down products: dimethylarsino-cysteine (DMAC), dimethylarsenic III (DMA III) and dimethylarsenic V (DMA V). We show that treatment with DMA III and DMA V does not lead to intracellular accumulation of arsenic, and correlates with their inability to induce cell death. However, DMAC is very similar to Dar in terms of intracellular accumulation of arsenic, G2/M arrest and cell death. As with Dar, thiols can inhibit DMAC effects. Therefore, we hypothesize that Dar gets transformed extracellularly into DMAC, which is imported via xCT or another cystine/cysteine importing system. We validated this hypothesis by shRNA knock-down of xCT. We also hypothesized that the increased cytotoxicity of Dar may be due to a decreased cytoprotective response, and therefore studied the expression of stress response enzymes after ATO and Dar treatment. We observed a lack of expression of one of the nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 phase-II (NRF2)-dependant detoxifying enzymes, heme-oxygenase 1 (HO-1), after Dar treatment, compared to ATO. We found that Dar does not recruit NRF2 to the HO-1 promoter's antioxidant response elements (AREs). We also found that Dar treatment did not recruit Brahma-related gene 1 (BRG1) coactivator to HO-1 AREs. BRG1 localization has been linked to cell cycle and we found that ATO induces a G1 arrest while Dar induces a G2/M arrest. Importantly, we found the Dar induced G2/M arrest to correlate with hyper-phosphorylated BRG1 causing it to be excluded from the chromatin, preventing HO-1 induction. In order to elucidate the cytoprotective effect of HO-1, we examined the cytotoxicity of ATO and Dar following pharmacological or genetic inhibition HO-1. We showed that inhibition of HO-1 increased the toxicity of ATO, but had no effect on Dar-induced apoptosis. We also showed that BRG1 silenced NB4 cells exhibit reduced HO-1 expression in response to ATO, and are more sensitive to ATO-induced apoptosis. We conclude that the lack of HO-1 activation is partially responsible for Dar's enhanced anti-tumor properties. Cells respond to arsenicals by increasing cystine uptake and HO-1 expression, which leads to protection against ATO but hypersensitivity to Dar. / Le trioxyde d'arsenic (ATO) est un traitement efficace contre la leucémie promyelocytaire aigue (APL), mais les autres types de cancers y sont peu sensibles à des doses utilisables en clinique. De plus, les cellules APL peuvent développer une résistance contre ATO. La résistance contre ATO et/ou une sensibilité modérée est associée à la modulation du transport de l'arsenic ou à une augmentation de l'expression d'enzymes cytoprotectrices. Darinaparsin (S-dimethylarsino-GSH; Dar) est un dérivé d'arsenic, inducteur d'apoptose, plus puissant qu'ATO dans plusieurs lignées cellulaire malignes et dans des blasts de patient APL. La dose maximum tolérée pour Dar est 35 fois plus élevée par rapport à ATO. Les cellules APL résistantes à ATO sont sensibles à Dar. Dar s'accumule plus dans la cellule qu'ATO, ce qui nous a menés vers l'hypothèse selon laquelle l'import de Dar contribue à son efficacité élevée. Nous montrons qu'ATO et Dar induisent l'expression de l'importateur de cystine xCT. Nous avons trouvé que des thiols extracellulaires inhibent l'accumulation intracellulaire de Dar, ainsi que l'apoptose. Ainsi, nous avons formulé l'hypothèse selon laquelle les thiols peuvent empêcher l'import de Dar. GSH en tant que telle n'est pas importée dans la cellule, nous avons donc pensé qu'il serait improbable que Dar entre dans la cellule sans être modifié. L'analyse structurelle de Dar révèle des produits potentiels de dégradation : dimethylarsino-cysteine (DMAC), dimethylarsenic III (DMA III) et dimethylarsenic V (DMA V). Nous montrons que DMA III et DMA V ne conduisent pas à l'accumulation intracellulaire d'arsenic, ce qui correspond à leur inaptitude à induire la mort cellulaire. Cependant, DMAC est très similaire en terme d'accumulation intracellulaire d'arsenic, arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et mort cellulaire. Tout comme avec Dar, les thiols peuvent inhiber les effets de DMAC. Ainsi, nous formulons l'hypothèse selon laquelle Dar est transformé à l'extérieur de la cellule en DMAC, qui est importé via xCT ou d'autres systèmes d'import de la cysteine/cystine. Nous avons validé cette hypothèse grâce à une atténuation de l'expression de xCT par shRNA. Nous avons également formulé l'hypothèse selon laquelle la cytotoxicité accrue de Dar pourrait être due à une réponse cytoprotectrice décrue, et avons donc étudié l'expression des enzymes de réponse au stress. Nous avons observé un manque d'expression d'une des enzymes de détoxification dépendantes du facteur nucléaire erythroid-derived 2-like 2 phase-II (NRF2), heme-oxygenase 1 (HO-1), après le traitement avec Dar, en comparaison avec ATO. Nous montrons que Dar ne recrute pas NRF2 à l'élément de réponse antioxydante (ARE) du promoteur de HO-1. Nous montrons aussi que le traitement avec Dar ne recrute pas le co-activateur Brahma-related gene 1 (BRG1) au ARE de HO-1. La localisation de BRG1 a été reliée au cycle cellulaire et nous avons montré que ATO induit un arrêt en phase G1 tandis que Dar induit un arrêt en phase G2/M. Nous avons montré qu'il y a une corrélation entre l'arrêt en phase G2/M induit par Dar et une hyper-phosphorylation de BRG1 induisant son exclusion de la chromatine, empêchant ainsi l'induction de HO-1. De façon à élucider l'effet cytoprotectif de HO-1, nous avons examiné la cytotoxicité de ATO et Dar après une inhibition pharmacologique ou génétique de HO-1. Nous avons montré que l'inhibition de HO-1 augmente la toxicité d'ATO mais pas celle de Dar. Nous avons également montré que des cellules NB4 n'exprimant plus BRG1 ont une expression réduite d'HO-1 en réponse à ATO, et sont plus sensibles à l'apoptose induite par ATO. Nous concluons que le manque d'activation de HO-1 est partiellement responsable de l'efficacité anti-tumorale accrue de Dar. Les cellules répondent à l'arsenic en augmentant l'import de la cystine et l'expression d'HO-1, ce qui conduit à une protection face à ATO mais à une hypersensibilité à Dar.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119553 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Garnier, Nicolas |
| Contributors | Wilson H Miller (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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