Peptidoglycan-derived muramyl dipeptide (MDP) activates the host immune response through the NOD2 receptor. Mycobacteria produce an unusual, glycolylated form of MDP, through the action of the enzyme N-acetyl muramic acid hydroxylase (NamH), that is more potent and more efficacious at inducing NOD2-mediated host responses. We set out to test the importance of this modification in M. tuberculosis by disrupting the namH gene (Rv3818). An allelic exchange strategy using a thermosensitive sacB-containing vector was used to create M. tuberculosis ∆namH strain which was confirmed by Southern blot and then complemented with an integrative plasmid. HPLC analysis revealed the namH knockout was devoid of N-glycolyl muramic acid. In vitro, the namH knockout had no alteration in either growth kinetics or cellular morphology, while it was mildly more susceptible to ampicillin and no more susceptible to lysozyme compared to the parent strain. In vivo, namH disruption resulted in increased pathology in the lungs of C57BL/6 mice at early time points, with reduced lymphocytic infiltration to the site of infection. As namH disruption did not result in any differences in the bacterial burden, these results suggest that the modified MDP is critical to the immunogenicity of M. tuberculosis. To test this, the namH knockout was introduced into a mouse devoid of an adaptive immune response, where it led to prolonged survival. Ongoing studies are testing the effect of namH disruption in macrophage culture and testing the NOD2-dependence of the in vivo phenotype, as well as the long-term survival of DBA2-C57Bl/6 hybrid mice infected with the namH knockout strain. / Le muramyl dipeptide (MDP) dérivé de peptidoglycan actionne la réponse immunitaire de l'hôte via le récepteur Nod2. Les mycobactéries produisent une forme inhabituelle de MDP qui est glycosylé, grâce à l'enzyme hydroxylase d'acide muramique N-acétylé (NamH). Cette forme de MDP est plus puissante et plus efficace pour induire une réponse immunitaire de l'hôte via le récepteur Nod2. On a testé l'importance de cette modification dans la M. tuberculosis en interrompant le gêne namH (Rv3818). La souche M. tuberculosis∆namH a été créée par échange allélique en utilisant un vecteur thermosensible qui contient un sacB. Cette modification à en suite été confirmée par un Southern blot puis complémenté avec un plasmide intégratif. Une analyse à l'aide de chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) à montré que le namH knockout n'avait pas d'acide N-glycolyl-muramique. In vitro, le namH knockout n'avait aucun changement dans sa croissance où sa morphologie cellulaire, tandis qu'il été plus susceptible à l'ampicilline et ni plus ou moins susceptible aux lysozymes en comparaison à la souche parentale. In vivo, l'interruption du namH à mené à une pathologie plus importante des poumons de souris C57BL/6 tôt dans l'infection, et a réduit l'infiltration lymphocytique après deux semaines d'infection. Aucune différence à été notée dans le nombre d'unités formant des colonies (CFU), ce qui suggère que le MDP modifié est nécessaire à l'immunogénécité de la M. tuberculosis. Le knock-out namH à prolongé la survie des souris infectées qui manquent un système immunitaire adaptif. Des études en-cours testent l'effet de l'interruption du namH dans des cultures de macrophages et testent la dependence-Nod2 de phénotype in vivo. Aussi, elles testent la survie à long-terme de souris hybrides DBA2-C57BI/6 infectées avec la souche knock-out namH.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.103751 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Hansen, Jesse |
| Contributors | Marcel A Behr (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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