Bei Yeast Two-Hybrid Untersuchungen wurde in unserer Arbeitsgruppe das RNA-Bindungsprotein hnRNP-R als Interaktionspartner von SMN gefunden und es konnte gezeigt werden, dass hnRNP-R mit SMN in Axonen von primären Motoneuronen kolokalisiert (Rossoll et al., 2002). hnRNP-R assoziiert mit der β-Aktin mRNA und nach Überexpression kommt es zu einer Akkumulation von β-Aktin in den Wachstumskegeln von neuronalen Zellen, sowie zu verstärktem Neuritenwachstum bei PC12 Zellen. Wird die SMN-Bindungsdomäne von hnRNP-R deletiert, ist dieser Effekt stark reduziert (Rossoll et al., 2003). Auf diesen in vitro Befunden ist die Hypothese begründet, dass hnRNP-R an der Translokation der β-Aktin mRNA in die Wachstumskegel von neuronalen Zellen beteiligt ist. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle von hnRNP-R bei der Entwicklung in Neuronen des Nervensystems näher untersucht. Dazu wurden Zebrafisch Embryonen als in vivo Modellsystem für Morpholino vermittelte Knockdown Untersuchungen gewählt. Zunächst wurde ein gegen murines Protein hergestelltes hnRNP-R Antiserum charakterisiert und gezeigt, dass es das Zebrafisch Protein spezifisch erkennt. Dieses Antiserum wurde in Western Blot Analysen verwendet um den hnRNP-R Knockdown in Zebrafisch Embryonen zu verifizieren. Bei den hnRNP-R Morpholino injizierten Embryonen konnten dosisabhängig axonale Veränderungen beobachtet werden. Diese Veränderungen stimmen mit einem Krankheitsmodell für SMA im Zebrafisch überein. Es konnte gezeigt werden, dass das Überleben primärer Motoneurone in Zebrafisch Embryonen nicht beeinträchtigt ist und dass andere neuronale Zellen keine signifikante Beeinflussung durch einen hnRNP-R Knockdown erfahren. Um die Spezifität des axonalen Phänotyps, der durch hnRNP-R Knockdown hervorgerufen wurde zu belegen, wurde mit muriner hnRNP-R mRNA ein Rescue-Experiment durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass dabei der axonale Phänotyp weitestgehend wieder aufgehoben wurde. Parallel zu den Zebrafisch Experimenten wurde ein hnRNP-R Knockout Konstrukt mittels homologer Rekombination in Escherichia coli hergestellt und in murine embryonale Stammzellen elektroporiert. Die Charakterisierung einer hnRNP-R Knockout Maus könnte weitere bedeutende Einsichten in die in vivo Funktionen von hnRNP-R bei der Embryonalentwicklung und speziell der Entwicklung von Motoneuronen gewähren. Um der Frage nach zu gehen, welche mRNAs in Wachstumskegeln von Axonen primärer Maus Motoneuronen zu finden sind oder durch Transportprozesse lokal akkumuliert sind,wurden Versuche unternommen, um mittels Laser-Mikrodissektion einzelne Wachstumskegel von Motoneuronen für Untersuchungen der enthaltenen mRNAs zu gewinnen. Erstmalig ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, kompartimentalisierte Kulturen von primären Motoneuronen der Maus zu etablieren. Damit wurde die Grundlage geschaffen, um RNA-Profile von distalen Zellkompartimenten wie den Axonen und Wachstumskegeln zu bestimmen. / In previous yeast two-hybrid studies, we have shown that hnRNP-R is an interaction partner of SMN and that it co-localises with SMN in axons of primary motor neurons (Rossoll et al., 2002). hnRNP-R associates with the β-actin mRNA and after overexpression, an accumulation of β-actin in growth cones of neuronal cells and elongated neurite growth of pc12 cells could be observed. If the SMN binding domain of hnRNP-R was deleted, this effect was strongly reduced (Rossoll et al., 2003). On this in vitro observations the hypothesis is based, that hnRNP-R plays an important role in the translocation of β-actin mRNA to the growth cones of neuronal cells. For that reason, the role of hnRNP-R in the development of neuronal cells of the nervous system was investigated in more detail, in line with this thesis. We have chosen embryonic zebrafish as an in vivo model system for morpholino mediated knockdown analysis of hnRNP-R. First of all an antiserum that has been generated against murine hnRNP-R protein was characterised and it could be shown that it specifically recognises the zebrafish protein. This antiserum was used in western blot analysis to verify the hnRNP-R knockdown in embryonic Zebrafish. Dose dependent axonal phenotypes could be described in hnRNP-R morpholino injected embryos, that resembled the alterations, observed in a disease model for SMA in zebrafish. We could show that the survival of motor neurons in zebrafish embryos was not impaired and that other populations of neuronal cells, were not significantly affected by the hnRNP-R knockdown. To prove the specificity of the axonal phenotype after hnRNP-R knockdown, a rescue experiment with co-injected mouse hnRNP-R mRNA has been performed, that nearly abolished the axonal phenotype. In parallel to the zebrafish experiments an hnRNP-R knockout construct was made by homologues recombination in Escherichia coli. This construct has been electroporated into embryonic stem cells of mice, and obtained clones have been screened. The characterisation of an hnRNP-R knockout mouse could reveal important insights of in vivo functions of hnRNP-R in embryonic development and especially the development of motor neurons. To answer the question, which mRNAs are located in growth cones of primary mouse motor neurons, or are locally accumulated due to mRNA transport processes, growth cones of primary mouse motor neurons have been cut by laser micro dissection. For the first time, compartmentalised cell cultures of primary motor neurons could be established during this thesis, providing the background to generate detailed RNA profiles of distal cell compartments like axons and growth cones.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:4885 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Glinka, Michael |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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