Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide with 84 amino acids and it is the
most important peptide regulator for calcium and phosphate ion homeostasis, maintaining
bone structure. Recombinant human parathyroid hormone, rhPTH (1-34), produced by DNA
technology in Escherichia coli contain the active amino-terminal fragment of the full length
hPTH and is currently being used worldwide for the treatment of osteoporosis at high risk of
fractures in postmenopausal women and men with osteoporosis primary or hypogonadal.
Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography
(SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of recombinant human
parathyroid hormone (rhPTH 1-34) in biopharmaceutical formulations. A gradient RP-LC
method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained
at 40 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1 M sodium sulphate buffer, pH 2.3, and the
mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S
2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.1
M phosphoric acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.7 mL/min.
Cromatographic separation was obtained with retention times of 12.2 min, and 13.2 min, and
was linear over the concentration range of 1-250 μg/mL (r
2 = 0.9997) and 2-300 μg/mL (r
2 =
0.9993), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214
nm. The limits of detection and quantitation were 0.44 and 1.47 μg/mL, respectively, for the
RP-LC and 0.79 and 2.63 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation
studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the
accuracy was 100.49% and 100.22%, with bias lower than 1.12% and than 0.81%. Moreover,
the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed
significant differences (p< 0.05) compared to intact molecule. The validated methods were
applied for the determination of rhPTH and related proteins in biotechnology-derived
products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.64% and
1.31% for the RP-LC and SE-LC related to the in vivo bioassay, and of 0.98% and 0.31%
higher, compared to the in vitro cell culture assay, respectively. It is concluded that represents
a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby
assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84
aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato,
e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH
(1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de
aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado
clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa
e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho
foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR)
e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de
produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18
(150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato
de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método
por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25
ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão
isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos
(DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min,
sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 =
0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e
quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e
2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também
demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22,
com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além
disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais
apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos
propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas
relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os
bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores
para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31%
superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer
procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia
terapêutica do produto biotecnológico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/5945 |
| Date | 31 January 2013 |
| Creators | Stamm, Fernanda Pavani |
| Contributors | Dalmora, Sergio Luiz, Ribela, Maria Teresa de Carvalho Pinto, Canto, Gizele Scotti do |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFSM, BR, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 201000000000, 400, 500, 300, 300, 500, c5c3d2e7-af0f-4f36-b006-046daf37340a, 3400ada4-2330-4cb4-a6e5-88c19f5ab580, c8f616ed-548b-4066-9e56-6b0f6146a148, 526f2155-c289-4a9a-ab68-611b482916de |
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