Das Immediate-Early Protein 2 (IE2) des humanen Zytomegalievirus ist ein essentieller Regulationsfaktor des lytischen Infektionszyklus. Es aktiviert verschiedene early Promotoren, autoreprimiert seine eigene Expression und besitzt darüber hinaus auch zellzyklusregulatorische Aktivitäten. Um einzelne Funktionen des IE2 Proteins gezielt analysieren zu können, ist eine genaue Kenntnis seiner regulatorischen Domänen unabdingbar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher eine Struktur-Funktionsanalyse des IE2 Proteins durchgeführt mit dem Ziel, seine funktionellen Domänen genauer zu charakterisieren. Hierfür wurden verschiedene IE2-Mutanten hergestellt und ihre Aktivität im Hinblick auf Transaktivierung, Autorepression und DNA-Bindung sowie Zellzylusarrestinduktion bestimmt. Die Untersuchungen ergaben, dass innerhalb einer Core-Region im C-Terminus des Proteins (AS 450-544) die regulatorischen Domänen der untersuchten Funktionen überlappen und hier schon kleinere Mutationen zu einem Funktionsverlust führen. Im Gegensatz dazu ist der Bereich N-terminal des Core deutlich weniger sensitiv gegenüber Mutationen. Hier konnten Sequenzen identifiziert werden, die spezifisch für einzelne Funktionen wie die Transaktivierung oder die Zellzyklusarrestinduktion erforderlich sind. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine im bisherigen Verständnis essentielle putative Zinkfingerdomäne außerhalb des Core liegt und für die Funktionalität des Proteins, vor allem für seine DNA-Bindung, nicht benötigt wird. Somit ist der Bereich, in dem die regulatorischen Domänen der untersuchten Funktionen überlappen, deutlich kleiner, als bisher angenommen. Vor diesem Hintergrund lässt sich eine Strategie für die Erstellung von diskriminierenden Virusmutanten ableiten, bei der Einzelfunktionen von IE2 im Viruskontext eliminiert und somit im Sinne ihrer physiologischen Relevanz analysierbar werden. / The Immediate Early Protein 2 (IE2) of human cytomegalovirus is an essential regulatory factor of the viral replicative cycle. It fulfills several functions including transactivation, negative autoregulation and cell cycle regulation. In order to analyse the physiological significance of each of the IE2 functions a precise knowledge of the regulatory protein domains is needed. Therefore, a structure-function analysis of the IE2 protein was performed in this work. Different sets of IE2 mutants were tested in parallel with regard to transactivation, DNA-binding, autoregulation and cell cycle regulation. We found the IE2 protein to contain an unexpectedly clear-cut core domain (amino acids (aa) 450-544) that is defined by its absolute sensitivity to any kind of mutation. In contrast, the region adjacent to the core (aa 290-449) generally displays greater tolerance towards mutations. Although specific sequences correlate with distinct IE2 activities none of the mutations analysed completely abolished any particular function. The core is separated from the adjacent region by the putative zinc finger (428-452) which was found to be entirely dispensable for any function tested. Our work supports the view that the 100 amino acids of the core domain hold the key to most functions of IE2. A systematic, high-density mutational analysis of this region may identify informative mutants which discriminate between various IE2 functions. Such mutants could then be tested in a viral background.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/15849 |
| Date | 17 January 2005 |
| Creators | Asmar, Jasmin |
| Contributors | Hagemeier, Christian, Krüger, Detlev H., Messerle, Martin |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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