Die vorliegende Arbeit behandelt die Oberflächenmodifikation von Nanodiamanten (ND) aus der Detonationssynthese und die anschließende Konjugation von einzel- bzw. doppelsträngiger DNA an die zuvor eingeführten funktionellen Gruppen. Als Ausgangsmaterialien wurden zwei Nanodiamantpulver mit unbekannter Oberflächenbelegung eingesetzt, deren Charakterisierung durch elektronenmikroskopische Methoden erfolgte. Weiterhin wurden kommerziell modifizierte ND mit definierter Oberflächenbelegung (Amino- und Hydroxylgruppen) verwendet.
Für potenzielle Anwendungen von ND wird eine monofunktionale Oberfläche angestrebt, die u. a. über Oxidation oder Reduktion der durch den Herstellungsprozess eingeführten primären funktionellen Gruppen realisiert werden kann. Die dadurch erzeugten sekundären Funktionen ermöglichen die kovalente bzw. nichtkovalente Anbindung weiterer Substanzen, z. B. von Biomolekülen, an die Oberflächen der ND-Partikel. Die hier beschriebene Konjugation von DNA, an die mit Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen modifizierten Partikeloberflächen, erfolgte durch die Generierung von Amid-, Phosphodiester- und Isoharnstoffbindungen. Der Erfolg der Konjugationen wurde mit Hilfe von Infrarotspektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Fluoreszenz der Konjugate beruhte dabei auf Fluoreszenzfarbstoffen, die an die DNA-Moleküle gebunden waren.
Darüber hinaus wird die Herstellung einer kolloidalen ND-Suspension beschrieben, von der die Partikelgrößen und das Zeta-Potenzial bestimmt wurden. Kolloidale Suspensionen ermöglichen aufgrund der geringen Partikelgrößen diverse biologische und medizinische Anwendungen von ND.
Mit den hier präsentierten Ergebnissen erweitert sich der Kenntnisstand zur Konjugation von DNA an ND aus der Detonationssynthese. Die angewandte Methodik kann ebenso auf andere Substanzen wie Proteine oder Chemotherapeutika übertragen werden. Derart funktionalisierte Partikel besitzen ein großes Potenzial für die weitere Anwendung in der Biomedizin und Nanotechnologie.:1 Einleitung 1
2 Theoretische Grundlagen 6
2.1 Nanodiamant 7
2.1.1 Historische Betrachtungen zur Detonationssynthese 7
2.1.2 Herstellung von Diamant 8
2.1.3 Aufbereitung von Nanodiamanten aus der Detonationssynthese 11
2.1.4 Struktur und Eigenschaften von Diamant 12
2.1.5 Homogenisierung der Oberflächenbelegung 16
2.1.6 Aggregation und Deaggregation von Nanodiamant-Partikeln 20
2.1.7 Anwendungen von Nanodiamant-Partikeln 21
2.2 Aptamere 26
2.2.1 Strukturbildung und Bindungsmechanismen 26
2.2.2 Zielsubstanzen 28
2.2.3 Vergleich von Aptameren und Antikörpern 29
2.2.4 Herstellung von Aptameren – Der SELEX-Prozess 32
2.2.5 Anwendungsfelder für Aptamere 34
2.3 Konjugation von Nanopartikeln mit Biomolekülen 38
2.4 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 46
2.4.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 46
2.4.2 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) 47
2.4.3 Bestimmung des Zeta-Potenzials durch elektrophoretische Licht-streuung (ELS) 48
2.5 Methoden zur Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 52
2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 52
2.5.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 53
2.5.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 54
2.6 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 56
2.6.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 56
2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie 60
3 Material und Methoden 62
3.1 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 62
3.1.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 62
3.1.2 Bestimmung von Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und Zeta-Potenzial 63
3.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 64
3.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 64
3.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 65
3.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 65
3.3 Chemische Modifikation von Nanodiamanten 66
3.3.1 Verwendete Materialien und Geräte 67
3.3.2 Einführung von Carboxylgruppen 68
3.3.3 Einführung von Hydroxylgruppen 69
3.3.4 Einführung von Aminogruppen 70
3.4 Herstellung von Nanodiamant-Aptamer-Konjugaten 73
3.4.1 Verwendete Materialien und Geräte 73
3.4.2 Konjugation über Amidbindungen 77
3.4.3 Konjugation über Ester- und Phosphodiesterbindungen 81
3.4.4 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 85
3.5 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 88
3.5.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 88
3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie 89
4 Ergebnisse und Diskussion 92
4.1 Charakterisierung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 92
4.1.1 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung 92
4.1.2 Bestimmung des Zeta-Potenzials 93
4.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulvern 98
4.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 98
4.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 101
4.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 107
4.3 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 117
4.3.1 Nanodiamanten: Originalmaterial und modifizierte Nanodiamanten 118
4.3.1.1 Nanodiamanten – Originalmaterial 118
4.3.1.2 Modifikation mit Carboxylgruppen (ND-COOH) 122
4.3.1.3 Modifikation mit Hydroxylgruppen (ND-OH) 123
4.3.1.4 Modifikation mit Aminogruppen (ND-NH2) 128
4.3.2 Nanodiamant-DNA-Konjugate 138
4.3.2.1 Konjugation über Amidbindungen 140
4.3.2.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 144
4.3.2.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 150
4.4 Fluoreszenzmikroskopie an Nanodiamant-DNA-Konjugaten 154
4.4.1 Konjugation über Amidbindungen 154
4.4.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 157
4.4.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 161
5 Zusammenfassung und Ausblick 165
6 Literaturverzeichnis 170
Anhang I
A-1 Parameter der Partikelgrößen- und Zeta-Potenzial-Messungen I
A-2 Nukleotidsequenz von EF1a III
A-3 GFP-Filter-Spektrum IV
A-4 FT-IR-Spektren von Nanodiamanten V
A-5 FT-IR-Spektren von Nanodiamant-DNA-Konjugaten X
Verzeichnis der Formelzeichen XIV
Abkürzungsverzeichnis XV
Eigene wissenschaftliche Beiträge XVIII
Danksagung
Erklärung / The present study deals with the surface modification of nanodiamonds (ND) from detonation synthesis and the subsequent conjugation of both single and double stranded DNA to previously introduced functional groups. As starting materials two kinds of nanodiamond powders with unknown surface configuration were used. Both types of ND were characterized by electron-microscopic methods. Furthermore, commercially modified ND with defined surface configuration (amino and hydroxyl groups) were applied.
Potential applications of ND require a mono-functional surface, that can be realized e. g. via oxidation or reduction of the primary functional groups introduced during the production process. The thereby generated secondary functions permit the covalent or non-covalent linking of further substances onto the surfaces of ND particles. Conjugation of DNA, as described here, onto the carboxyl-, hydroxyl- or aminomodified particle surfaces was accomplished by generating of amino, phosphodiester and isourea bonds. The success of conjugations has been examined by infrared spectroscopy and fluorescence microscopy. The fluorescence of conjugates based on fluorescent dyes bound to the DNA molecules.
Furthermore, the fabrication of a colloidal ND suspension is described, of which the particle sizes and the Zeta potential have been determined. Colloidal suspensions facilitate various biological and medical applications of ND on the basis of low particle sizes.
The presented results enlarge the state of knowledge about the conjugation of DNA on ND from detonation synthesis. The applied methodology may also be transferred to other substances like proteins or chemotherapeutics. In this way, functionalized particles have a big potential for further application in biomedicine and nanotechnology.:1 Einleitung 1
2 Theoretische Grundlagen 6
2.1 Nanodiamant 7
2.1.1 Historische Betrachtungen zur Detonationssynthese 7
2.1.2 Herstellung von Diamant 8
2.1.3 Aufbereitung von Nanodiamanten aus der Detonationssynthese 11
2.1.4 Struktur und Eigenschaften von Diamant 12
2.1.5 Homogenisierung der Oberflächenbelegung 16
2.1.6 Aggregation und Deaggregation von Nanodiamant-Partikeln 20
2.1.7 Anwendungen von Nanodiamant-Partikeln 21
2.2 Aptamere 26
2.2.1 Strukturbildung und Bindungsmechanismen 26
2.2.2 Zielsubstanzen 28
2.2.3 Vergleich von Aptameren und Antikörpern 29
2.2.4 Herstellung von Aptameren – Der SELEX-Prozess 32
2.2.5 Anwendungsfelder für Aptamere 34
2.3 Konjugation von Nanopartikeln mit Biomolekülen 38
2.4 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 46
2.4.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 46
2.4.2 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) 47
2.4.3 Bestimmung des Zeta-Potenzials durch elektrophoretische Licht-streuung (ELS) 48
2.5 Methoden zur Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 52
2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 52
2.5.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 53
2.5.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 54
2.6 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 56
2.6.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 56
2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie 60
3 Material und Methoden 62
3.1 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 62
3.1.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 62
3.1.2 Bestimmung von Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und Zeta-Potenzial 63
3.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 64
3.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 64
3.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 65
3.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 65
3.3 Chemische Modifikation von Nanodiamanten 66
3.3.1 Verwendete Materialien und Geräte 67
3.3.2 Einführung von Carboxylgruppen 68
3.3.3 Einführung von Hydroxylgruppen 69
3.3.4 Einführung von Aminogruppen 70
3.4 Herstellung von Nanodiamant-Aptamer-Konjugaten 73
3.4.1 Verwendete Materialien und Geräte 73
3.4.2 Konjugation über Amidbindungen 77
3.4.3 Konjugation über Ester- und Phosphodiesterbindungen 81
3.4.4 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 85
3.5 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 88
3.5.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 88
3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie 89
4 Ergebnisse und Diskussion 92
4.1 Charakterisierung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 92
4.1.1 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung 92
4.1.2 Bestimmung des Zeta-Potenzials 93
4.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulvern 98
4.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 98
4.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 101
4.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 107
4.3 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 117
4.3.1 Nanodiamanten: Originalmaterial und modifizierte Nanodiamanten 118
4.3.1.1 Nanodiamanten – Originalmaterial 118
4.3.1.2 Modifikation mit Carboxylgruppen (ND-COOH) 122
4.3.1.3 Modifikation mit Hydroxylgruppen (ND-OH) 123
4.3.1.4 Modifikation mit Aminogruppen (ND-NH2) 128
4.3.2 Nanodiamant-DNA-Konjugate 138
4.3.2.1 Konjugation über Amidbindungen 140
4.3.2.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 144
4.3.2.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 150
4.4 Fluoreszenzmikroskopie an Nanodiamant-DNA-Konjugaten 154
4.4.1 Konjugation über Amidbindungen 154
4.4.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 157
4.4.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 161
5 Zusammenfassung und Ausblick 165
6 Literaturverzeichnis 170
Anhang I
A-1 Parameter der Partikelgrößen- und Zeta-Potenzial-Messungen I
A-2 Nukleotidsequenz von EF1a III
A-3 GFP-Filter-Spektrum IV
A-4 FT-IR-Spektren von Nanodiamanten V
A-5 FT-IR-Spektren von Nanodiamant-DNA-Konjugaten X
Verzeichnis der Formelzeichen XIV
Abkürzungsverzeichnis XV
Eigene wissenschaftliche Beiträge XVIII
Danksagung
Erklärung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:30724 |
| Date | 04 August 2017 |
| Creators | Pohl, Andrea |
| Contributors | Opitz, Jörg, Bley, Thomas, Krüger, Anke, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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