A imunização transcutânea (IT) é uma técnica promissora de vacinação, na qual a formulação contendo o antígeno é aplicada sobre a pele para induzir resposta imune. O sucesso desse tipo de imunização ocorre devido à presença de células apresentadoras de antígenos (APCs) na epiderme viável, as quais são potentes estimuladoras de linfócitos T. Porém, é necessário que o antígeno transponha a barreira imposta pelo estrato córneo e atinja a epiderme viável em concentrações adequadas para que uma resposta imune efetiva seja induzida. Neste trabalho, a influência da iontoforese, método físico que utiliza uma corrente elétrica fraca para aumentar a penetração cutânea de fármacos, foi investigada pela primeira vez na IT. Sua associação com lipossomas, para direcionar a liberação do antígeno para a epiderme viável, e com nanopartículas de prata (NPAg), para potencializar a resposta imune, também foi avaliada pela primeira vez. A ovalbumina (OVA) foi utilizada como antígeno modelo e a injeção subcutânea de OVA como controle positivo da imunização. Foram obtidos lipossomas aniônicos contendo 5 mg/mL de OVA e catiônicos contendo 0,25 mg/mL de OVA, adicionados ou não de NPAg. Os lipossomas aniônicos apresentaram tamanho médio de aproximadamente 120 nm e eficiência de encapsulação da OVA de 78,4%. Os lipossomas catiônicos apresentaram tamanho médio de aproximadamente 260 nm e eficiência de encapsulação da OVA de 83,08%. A adição das NPAg não alterou significativamente o tamanho dos lipossomas, mas alterou o potencial zeta (de -7,5 mV para -14 mV para os lipossomas aniônicos e de +41 mV para +36 mV para os lipossomas catiônicos). As microscopias de força atômica e eletrônica de transmissão (MET) confirmaram a presença de vesículas lipossomais, sendo que a TEM mostrou as NPAgs dispersas no meio aquoso externo dos lipossomas aniônicos e no meio aquoso interno dos lipossomas catiônicos. A OVA e os lipossomas se mostraram estáveis ao processo de obtenção e frente a corrente elétrica. Nos estudos de penetração cutânea in vitro observou-se que a encapsulação da OVA nos lipossomas direcionou sua liberação para a epiderme viável. A associação com a iontoforese aumentou 108 vezes a liberação da OVA na epiderme viável quando lipossomas aniônicos contendo NPAg foram administrados e 92 vezes quando lipossomas catiônicos contendo NPAg foram administrados. A presença das NPAg nas formulações aumentou a quantidade de OVA na epiderme viável quando a iontoforese foi utilizada, mas diminuiu sua penetração passiva. As quantidades de OVA penetradas por iontoforese anódica e catódica a partir dos lipossomas aniônicos não foram significativamente diferentes. O coeficiente de penetração da OVA na epiderme viável a partir da iontoforese dos lipossomas aniônicos foi 1,6 vezes (na ausência de NPAg) e 39 vezes (na presença de NPAg) maior do que o dos lipossomas catiônicos. Nos experimentos de imunização transcutânea in vivo observou-se que as quantidades de OVA que penetraram a pele por iontoforese foram suficientes para induzir resposta imune humoral semelhante a induzida pela injeção subcutânea da OVA para os lipossomas aniônicos, na presença e ausência de NPAg, e para o lipossoma catiônico apenas na presença da NPAg, sugerindo que as NPAg, na presença de baixas concentrações de OVA, funcionam como adjuvantes imunológicos. A iontoforese anódica das formulações, assim como a injeção subcutânea da OVA, não estimularam resposta imune celular significativa. A iontoforese catódica, no entanto, induziu tanto resposta humoral como celular, além de estimular a produção de INF-? e o recrutamento de células apresentadoras de antígeno, tanto no baço como nos linfonodos inguinais. Sendo assim, a iontoforese de lipossomas contendo OVA e NPAg foi capaz de direcionar a liberação da OVA para a epiderme, induzir altos títulos de anticorpos IgG1 e ainda ativar a resposta imune celular, sendo uma estratégia promissora para a IT. / Transcutaneous immunization (TI) is a promising strategy for vaccine in which the antigen-containing formulation is applied to the skin to induce immune response. The success of this type of immunization occurs due to the presence of antigen presenting cells (APCs) in the viable epidermis, which are potent stimulator of T lymphocytes. However, the antigen should transpose the barrier imposed by the stratum corneum to reach the viable epidermis in appropriate concentrations so that an effective immune response is induced. In this work, the influence of iontophoresis, a physical method that uses a weak electrical current to increase skin penetration of drugs, was investigated for the first time in TI. Its association with liposomes, to target the antigen release to the viable epidermis, and with silver nanoparticles (NPAg), to enhance the immune response, was also evaluated for the first time. Ovalbumin (OVA) was used as a model antigen and OVA subcutaneous injection as a positive control of immunization. Anionic and cationic liposomes containing 5 mg/ml and 0.25 mg/mL of OVA, respectively, were obtained and were added or not by NPAg. Anionic liposomes had an average size of approximately 120 nm and 78,4% OVA encapsulation efficiency. Cationic liposomes had an average size of approximately 260 nm and 83,08% OVA encapsulation efficiency. The addition of NPAg did not significantly alter the size of the liposomes, but changed the zeta potential (-7.5 mV to - 14 mV for anionic liposomes and +41 mV to +36 mV for cationic liposomes). The atomic force microscopy and transmission electron microscopy (TEM) confirmed the presence of liposomal vesicles; TEM showed NPAgs dispersed in the external aqueous medium of the anionic liposomes and in the internal aqueous medium of the cationic liposomes. The OVA and the liposomes were stable during the preparation process and in front of the electric current. In the in vitro skin penetration studies it was observed that the encapsulation of OVA into liposomes directed their release to the viable epidermis. The association with iontophoresis increased 108-fold the release of OVA in the viable epidermis when anionic liposomes containing NPAg were administered and 92-fold when cationic liposomes containing NPAg were administered. The presence of NPAg in the formulations increased the amount of OVA released in the viable epidermis when iontophoresis was applied, but decreased OVA passive penetration. The amount of OVA penetrated by anodic and cathodic iontophoresis of anionic liposomes was similar. The OVA penetration coefficient in the viable epidermis from the iontophoresis of anionic liposomes was 1.6-fold (in the absence of NPAg) and 39- fold (in the presence of NPAg) greater than the iontophoresis of cationic liposomes. In transcutaneous immunization in vivo experiments, it was observed that the amount of OVA that penetrated the skin by iontophoresis was sufficient to induce similar humoral immune response than that induced by subcutaneous injection of OVA when anionic liposomes, in the presence and absence of NPAg, and cationic liposome, only in the presence of NPAg, were administered. These results suggest that NPAg in the presence of low concentrations of OVA acted as immunological adjuvants. Altough induced humoral immune response; anodal iontophoresis of the formulations as well as subcutaneous injection of OVA did not stimulate significant cellular immune response. Cathodic iontophoresis, on the other hand, induced both humoral and cellular immune response, as well as stimulating the production of IFN-? and the recruitment of antigen presenting cells, both in spleen and in inguinal lymph nodes. Therefore, iontophoresis of liposomes containing OVA and NPAg was able to target the release of OVA to the epidermis, induce high titers of IgG1 and activate the cellular immune response, being a promising strategy for TI.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12112015-112715 |
| Date | 24 September 2015 |
| Creators | Bernardi, Daniela Spuri |
| Contributors | Lopez, Renata Fonseca Vianna |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
Page generated in 0.0068 seconds