Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2010. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-08-19T20:33:18Z
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Previous issue date: 2010 / Este trabalho teve como objetivo principal investigar a imobilização da enzima β-
galactosidase comercial de Kluyveromyces lactis (Lactozym®), bem como caracterizar
a enzima livre e imobilizada visando sua aplicação na reação de hidrólise da lactose.
Foram feitos testes preliminares com três suportes diferentes para a imobilização
(alginato, quitosana e Eupergit® C), sendo que os valores de recuperação da atividade
enzimática foram, respectivamente, 2,43%, 6,27% e 41,86%, selecionando-se o suporte Eupergit® C como o mais promissor. Um planejamento Plackett-Burman, correspondente a 12 ensaios mais 3 réplicas no ponto central, foi proposto a fim de verificar os efeitos das variáveis temperatura, pH, força iônica, tempo de imobilização, concentração de galactose, concentração de íons Mg2+ e volume de enzima na imobilização de β-galactosidase em Eupergit® C. A força iônica e o pH foram as variáveis que apresentaram efeito significativo (p<0,1) na imobilização, sendo que o aumento da força iônica de 0,1 M para 1,5 M e o aumento do pH de 6,6 para 7,4
representaram aumento de 30,0% e redução de 17,3% na recuperação da atividade enzimática, respectivamente. À temperatura de 25°C, pH 6,6, concentração salina de 1,5 M, tempo de imobilização de 8 h, concentração de Mg2+ de 1 mM e 0,4 mL de enzima adicionada, atingiu-se 85% de recuperação da atividade enzimática. As enzimas livre e imobilizada, nas melhores condições em Eupergit® C, foram
caracterizadas quanto aos perfis de pH e temperatura, estabilidade térmica, parâmetros cinéticos e termodinâmicos. Quanto aos perfis de pH e temperatura, foram obtidos, para ambas, valores máximos de atividade enzimática em pH 6,6 e 45°C. Houve um ganho de estabilidade térmica com a imobilização enzimática, tendo-se observado um aumento de cerca de 4 vezes no tempo de meia-vida da enzima imobilizada a 45oC, em relação à livre, o que pode representar vantagens na utilização da enzima imobilizada em escala comercial. Os valores de energia de ativação para as enzimas livre e imobilizada foram, respectivamente, iguais a 35,28 kJ.mol-1 e 29,46kJ.mol-1; e os valores de energia de ativação da reação de desnaturação para as
enzimas livre e imobilizada foram iguais, respectivamente, a 266,12 kJ.mol-1 e 198,77
kJ.mol-1. Foram determinados os parâmetros cinéticos para as enzimas livre e imobilizada, sendo que os valores de Km, 30,33 mM e 104,00 mM, respectivamente,
representaram uma diminuição da afinidade da enzima pelo substrato com a imobilização, possivelmente devido a fatores estéricos e conformacionais. Parâmetros termodinâmicos foram calculados, evidenciando novamente a maior estabilidade térmica da enzima imobilizada e indicando que a perda de estabilidade de ambas as enzimas, livre e imobilizada, parece não estar associada a alterações relevantes na estrutura terciária. / Immobilization of b-galactosidase (Lactozym®) on Eupergit® C and its characterization
This study aimed to investigate the immobilization of commercial β-galactosidase from Kluyveromyces lactis (Lactozym®) and characterize the free and immobilized enzymes
for their application in lactose hydrolysis. Three preliminaries tests were carried out
with three different supports for immobilization (alginate, chitosan and Eupergit® C), and the values for recovery of enzyme activity were, respectively, 2.43%, 6.27% e 41.86%, selecting Eupergit® C as the most promising. A Plackett-Burman design,
composed of 12 assays over 3 central points was proposed in order to verify the effects
of temperature, pH, ionic strength, reaction time, galactose concentration, Mg2+
concentration and enzyme volume on β-galactosidase immobilization using Eupergit®
C support. The ionic strength and pH were the variables that presented significant effect (p<0.1) on immobilization. The increase in the ionic strength from 0.1 to 1.5 M and the decrease in pH from 6.6 to 7.4 represented an increase of 30.0% and a reduction of 17.3% in the recovery of enzyme activity, respectively. At 25°C, pH 6.6,
salt concentration of 1.5 M, immobilization for 8 h, 1 mM Mg2+ and 0.4 mL of enzyme
added, reached 85% recovery of enzymatic activity. The free and immobilized enzyme
on Eupergit® C were characterized,determining pH and temperature profiles, thermal stability, kinetic and thermodynamic parameters. pH and temperature profiles showed maximum activity at pH 6.6 and 45°C. There was a gain in thermal stability with the enzyme immobilization and there was an increase of about 4 times in the half-life of
immobilized enzyme at 45°C, which may represent advantages when using in a
commercial scale. The values of activation energy for free and immobilized enzymes
were, respectively, equal to 35.28 kJ.mol-1 and 29.46 kJ.mol-1, and the values of
activation energy of denaturation reaction for free and immobilized enzymes were
equal, respectively, to 266.12kJ.mol-1 and 198.77 kJ.mol-1. Kinetic parameters were
determined for the immobilized and free enzyme. Km values of 30.33 mM and 104.00
mM, respectively, represented a decrease of the affinity of the enzyme by the substrate
with immobilization, possibly due to steric and conformational factors. Thermodynamic
parameters were calculated, showing the higher thermal stability of the immobilized
enzyme and indicating that the loss of stability of both enzymes, immobilized and free, does not seem to be associated with significant changes in tertiary structure.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.furg.br:1/2584 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Campello, Graciella da Silva |
| Contributors | Burkert, Carlos André Veiga |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FURG, instname:Universidade Federal do Rio Grande, instacron:FURG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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