Pichia pastoris es identificada como una de las factorías celulares más eficientes para
la producción de proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas han sido expresadas
usando este sistema de expresión. P. pastoris combina la habilidad de crecer en
medios mínimos a altas densidades celulares con la de secreción de proteína
heteróloga, ayudando a su recuperación.
En este trabajo, la proteína modelo seleccionada es la lipasa recombinante de Rhizopus
oryzae (ROL). La producción heteróloga de ROL en cultivos fed-bach de P. pastoris
PAOX1 (Mut+) ha sido estudiada desde el punto de vista de la monitorización y control
del bioproceso, la modelización cinética y el diseño y desarrollo de estrategias
operacionales.
El primer paso en la investigación ha sido la estimación de la concentración de
biomasa, sustrato y velocidad específica de crecimiento (μ) mediante dos observadores
no lineales y uno lineal. El objetivo de este estudio ha sido comparar las prestaciones
de los diferentes algoritmos en bioproceso de P. pastoris.
La producción de proteína recombinante está estrechamente relacionada con la μ. Por
lo tanto, debido a su elevada relevancia en el bioproceso, μ fue estimada utilizando el
análisis de los gases de salida en línea o las medidas de la concentración de sustrato.
La biomasa y el sustrato fueron obtenidos directamente de sus correspondientes
balances de materia.
La estrategia de cultivo más frecuentemente utilizada para conseguir altas densidades
celulares y elevada producción de proteína heteróloga con el sistema PAOX1 (Mut+) es
la operación fed-batch. Las estrategias operacionales estándar están basadas en el
control de la concentración de sustrato próximas a cero (estrategias limitantes) o manteniendo la concentración a un valor contante (estrategias no limitantes). En
consecuencia se estudió el efecto de las estrategias operacionales fed-batch de metanol
no limitante (MNLFB) y metanol limitante (MLFB) en la producción de ROL. Éstas
son las estrategias de control más comunes que tienen como objetivo mantener
contantes las velocidades específicas claves: crecimiento celular (μ), consumo de
sustrato (qs) y producción de proteína (qp) a partir de la hipótesis de estado quasiestacionario
para el sustrato. Los resultados se analizaron con el objetivo de
determinar la condición más apropiada en función de rendimientos y productividades.
Las velocidades específicas medias y las variables de estado para varios cultivos fedbatch,
bajo condiciones de metanol limitante y no limitante, se usaron para el
desarrollo de un modelo macrocinético no estructurado para la producción heteróloga
de la ROL por el sistema P. pastoris PAOX1. Posteriormente, se ha realizado un metaanálisis
comparativo sobre la producción de varias proteínas heterólogas modelo para
P. pastoris bajo el promotor AOX1 y se ha desarrollado una estrategia general para
mejorar la producción de proteínas a partir de la cinética como clave para la
optimización del proceso.
Adicionalmente se ha estudiado y caracterizado la capacidad de transferencia de
oxigeno en diferentes biorreactores a escala laboratorio y piloto. El modelo de
transferencia de oxigeno ha sido también desarrollado y validado en la producción de
ROL en P. pastoris bajo el promotor AOX1. Finalmente, el modelo cinético
previamente desarrollado para la producción heteróloga de ROL y el modelo de
transferencia de oxigeno han sido aplicados para definir estrategias alternativas de
operación basadas en operaciones con oxígeno limitante (OLFB) comparándose con
las estrategias estándar. / Pichia pastoris is recognized as one of the most efficient cell factories for the
production of recombinant proteins. More than 500 proteins have been expressed
using this system. P. pastoris combines the ability of growing on minimal medium at
very high cell densities with secreting the heterologous protein, aiding to their
recovery.
In this work, the selected target protein has been is the recombinant Rhizopus oryzae
lipase (ROL). The heterologous ROL production in P. pastoris PAOX1 (Mut+) fed-batch
cultures has been studied for bioprocess monitoring and control, kinetic modelling,
and the design and development operational strategies.
The first step in the research has been the estimation of biomass, substrate and specific
growth rate (μ) by means of two non-linear observers and a linear estimator. The aim
of this study has been to compare the performance of the different algorithms in P.
pastoris bioprocesses.
Heterologous protein production is closely related to μ. So, due to its high relevance in
the bioprocess, μ has been estimated by on-line gas analyses or substrate concentration
measurements. Biomass and substrate have been straightforwardly obtained solving
their corresponding mass balances.
The most frequently used cultivation strategy to achieve high cell densities and high
heterologous protein production levels with PAOX1-(Mut+)-based system is the fedbatch
operation. The standard operational strategies are based on the control of the
substrate concentration close to zero (limiting strategies) or keeping the concentration
at a constant value (non-limiting strategies). Consequently, the effect of methanol nonlimiting
fed-batch (MNLFB) and methanol limited fed-batch (MLFB) operational strategies on ROL production has been studied. These most commonly applied control
strategies allow maintaining rather constant key specific rates: cell growth (μ),
substrate uptake (qs), and protein production (qp) through the quasi-steady state
hypothesis for substrate. Results have been analyzed in order to determine the most
suitable operating conditions in terms of yields and productivities.
Furthermore, mean specific rates and state variables for various fed-batch cultures,
under methanol limited and non-limited conditions were used for modeling. Hence, an
unstructured macrokinetic model for heterologous ROL production by a P. pastoris
PAOX1 based system has been developed. Then, a comparative meta-analysis of
heterologous protein production of various target proteins by P. pastoris under AOX1
promoter has been conducted and a general strategy for improving protein production
from process kinetics was developed as a key to bioprocess optimization.
Additionally, the characterization of oxygen transfer capacity in different
laboratory/pilot scale bioreactors has been studied. The oxygen transfer model was
also developed and validated in heterologous ROL production by P. pastoris under
AOX1 promoter. Finally, the previous kinetic model for heterologous ROL production
and oxygen transfer model have been applied to define alternative operational
strategies based on oxygen limited fed-batch operations (OLFB) and have been
compared to the standard strategies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/287984 |
| Date | 27 February 2015 |
| Creators | Barrigón de San Marcos, José Manuel |
| Contributors | Valero Barranco, Francisco, Montesinos Seguí, José Luis, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 260 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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