Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, ist für eine jährliche Todesrate von über einer Million Menschen verantwortlich. Rasch zunehmende Erregerresistenzen gegen gängige Antimalariamedikamente und das Fehlen eines Impfstoffes machen die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen und Medikamenten unerlässlich. Sexualstadienspezifische Oberflächenproteine des Parasiten sind attraktive Zielstrukturen für die Entwicklung von TBV, welche eine Entwicklung von P. falciparum in der Mücke unterbrechen. Die Suche nach multiplen tier- oder bakterienähnlichen, extrazellulären Adhäsionsdomänen im Genom von P. falciparum führte zur Identifizierung einer Familie von sechs Proteinen mit hochkonservierten Adhäsionsmodulen, die vermutlich an Parasit-Parasit- oder Parasit-Wirtsinteraktionen beteiligt sind, was sie zu potentiellen Kandidaten für Komponenten von TBV macht. Aufgrund ihrer gemeinsamen LCCL-Domäne wurden diese Proteine PfCCp1 bis PfCCp5 sowie PfFNPA benannt. PfFNPA besitzt keine LCCL-Domäne, es ist jedoch ähnlich aufgebaut wie PfCCp5 und wurde daher mit in die PfCCp-Familie integriert. Die in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisierenden PfCCp1- bis PfCCp3-Proteine werden während der Gametogenese teilweise freigesetzt und umgeben matrixähnlich entstehende Exflagellationszentren. In PfCCp2- und PfCCp3-defizienten Parasiten ist die Wanderung der Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücke blockiert. Sexualstadien-spezifische Expression und eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Erregers in der Mücke sind die Hauptkriterien für potentielle TBV-Kandidaten. Diese viel versprechenden Daten waren Anlass, in der vorliegenden Arbeit, die bisher nur hypothetischen PfCCp5- und PfFNPA-Proteine genauer zu untersuchen. Expressionsstudien von PfCCp5 und PfFNPA mittels RT-PCR, Western-Blot-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopischen-Analysen zeigten, dass sie sowohl plasmamembranassoziiert in der parasitophoren Vakuole als auch intrazellulär in reifen Gametozyten exprimiert werden. Beide Proteine sind in Gameto-zyten ab dem Stadium II detektierbar und weisen in unreifen Gametozyten ein punktiertes Expressionsmuster auf. In reifen Gametozyten konzentriert sich ihre Expression dagegen v. a. auf die Zellpole. Ferner werden PfCCp5 und PfFNPA auf der Oberfläche von Makrogameten, jedoch nicht in Mikrogameten und Ookineten exprimiert. Zusätzlich wird PfCCp5 in einem Teil reifer Schizonten eines gametozyten-bildenden Parasiten-Stammes exprimiert. Durch Integration eines Komplementations-Konstukts in die 3-untranslatierte Region von PfCCp5 bzw. PfFNPA konnte gezeigt werden, dass beide Gene genetisch manipulierbar sind. Mit PfCCp5- bzw. PfFNPA-KO-Konstrukten transfizierte WT-Parasiten wachsen nach erfolgter positiver Selektion jedoch nicht mehr. Diese Daten lassen vermuten, dass PfCCp5 und PfFNPA eine essentielle Funktion in den Blutstadien bzw. bei Gametozytenbildung haben. Zur weiteren Analyse von PfFNPA wurde ein verkürztes Protein durch Integration eines weiteren PfFNPA-KO-Konstrukts in den Locus von WT-Parasiten generiert. Erste Analysen des PfFNPA-KO-Phänotyps deuten darauf hin, dass durch die Ausschaltung der 3’-Region des Gens das Protein nicht mehr korrekt exprimiert wird, obwohl keine morphologischen Veränderungen der Blutstadien des Parasiten feststellbar sind. Außerdem werden PfCCp5 und PfFNPA ko-abhängig in PfCCp1-, PfCCp2- und PfCCp3-KO-Gametozyten exprimiert. Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass beide Proteine mit den anderen PfCCp-Mitgliedern interagieren. Affinitätschromato-graphiestudien deckten dann direkte Interaktionen einzelner PfCCp-Domänen auf. Hierbei sind v. a. die LCCL-, die SR- und die NEC- Domäne an Proteininteraktionen beteiligt, was die Hypothese einer Komplexbildung der PfCCp-Familie während der Gametogenese des Erregers stützt. Transmissionsblockierungsstudien sollen nun die Eignung ausgewählter PfCCp-Proteine als TBV-Komponenten näher beleuchten. Zunehmende Resistenzen gegen gebräuchliche Malariamedikamente veranlassen zur Suche nach neuen Angriffspunkten zur Behandlung der Erkrankung. Die maßgeblich an der Hämoglobinhydrolyse beteiligten plasmodialen Cysteinproteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 sind mögliche Ziele für die Entwicklung neuer Antimalariawirkstoffe. In der vorliegenden Arbeit wurden peptidomimetische 1,4-Benzodiazepin- und nicht-peptidische Etacrynsäurederivate in vitro auf ihre antiplasmodiale Wirkung an P. falciparum-Blutstadien getestet. Ein erstes Screening hatte gezeigt, dass die eine Vinylsulfonkopfgruppe tragenden 1,4 Benzodiazepinderivate rekombinant exprimiertes Falcipain-2 irreversibel hemmen. In vitro konnte dann auch eine antiplasmodiale Aktivität für diese Verbindungen festgestellt werden. Dockingstudien und HPLC-Assays mit den Etacrynsäurederivaten deckten eine Hemmung der Cysteinprotease Papain und der SARS-Mpro-Hauptprotease der Coronaviren auf. Weiterhin konnte in einem Screening an rekombinant exprimiertem Falcipain-2 und Falcipain-3 eine inhibitorische Wirkung für einen Teil dieser Etacrynsäurederivate festgestellt werden. Der In-vitro-Test an P. falciparum-Blutstadien deckte dann eine schwache antiplasmodiale Aktivität von fluorsubstituierten Etacrynsäurederivaten und von Derivaten mit einer modifizierten Etacrynsäurepartialstruktur auf. Der viel versprechendste Inhibitor dieser Studie wurde nun zur Identifizierung potentieller Bindungspartner mittels Affinitätsbindungsstudien biotyniliert. Zusammenfassend besitzen beide getesteten Wirkstoffklassen eine inhibierende Aktivität gegenüber Cysteinproteasen womit sie die Grundlage für die Entwicklung neuer, effektiverer plasmodialer Cysteinproteaseinhibitoren bieten. / The causative agent of Malaria tropica, Plasmodium falciparum, is responsible for more than 1 million deaths each year. The intensive search for new therapeutic strategies and drugs remains essential because of a rapidly increasing resistance of the pathogen against common available drugs and the persistant lack of a malaria vaccine. Sexual stage-specific surface proteins of the parasite are attractive targets for the development of transmission blocking vaccines (TBV), which are able to block the development of P. falciparum within the mosquito. The screening of the P. falciparum genome for multiple animal- or bacterial-like, extracellular adhesion domains identified a protein family with highly conserved adhesive modules consisting of six members. They are supposed to be involved in parasite-parasite or parasite-host interactions making them promising candidates for subunits of TBV. Due to a shared LCCL-domain these proteins were named PfCCp1 through PfCCp5 and PfFNPA. PfFNPA lacks this LCCL-domain but because of its similarity to PfCCp5 it was integrated into the PfCCp family. The three family members PfCCp1, PfCCp2 and PfCCp3 localize within the parasito-phorous vacuole of mature gametocytes and are partly released during gamete emergence surrounding exflagellation centers extracellularly in a matrix-like pattern. Functional disruption of PfCCp2 and PfCCp3 leads to a blockade of transition of sporozoites from the midgut oocysts to the salivary glands within the mosquito. Sexual stage-specific expression and an essential role for the parasite development within the mosquito are two major criteria for prospective components of TBV. These promising data gave reason for a detailed analysis of the so far only hypothetical PfCCp5 and PfFNPA proteins in the present work. Expression analysis of PfCCp5 and PfFNPA using RT-PCR, Western Blot, immunofluorescence assays and transmission electronmicroscopy revealed that they are intracellularly expressed as well as in association with the plasma membrane within the parasitophorous vacuole of mature gametocytes. Expression of both proteins is detectable in stage II gametocytes. They exhibit a punctuated expression pattern in immature gametocytes, but in mature gametocytes proteins are more restricted to the poles. PfCCp5 as well as PfFNPA are present on the surface of macrogametes but not in microgametes and their expression ceases during ookinete maturation. Additionally PfCCp5 is also expressed in a subset of schizonts of a gametocyte forming parasite strain. Through integration of a PfCCp5- and a PfFNPA-complementation construct it was possible to show that the genes are accessible for genetic manipulation. In contrast parasites transfected with either a PfCCp5- or a PfFNPA-KO-construct do not grow after positive selection. These data support the assumption that both proteins are essential for the parasite blood stages or for the development of gametocytes. For further characterization of PfFNPA a truncated protein was synthesized by integration of another PfFNPA-KO-construct into the WT-locus of the gene. First studies of the PfFNPA-KO phenotype revealed that disruption of the 3’-region of the gene results in an incorrect protein expression although the parasites blood stages do not exhibit morphological changes. Additionally PfCCp5 and PfFNPA are co-dependently expressed in PfCCp1-, PfCCp2- and PfCCp3-KO parasites. Co-immunoprecipitation studies showed interactions of these two proteins with the other PfCCp family members. Affinitychromatography studies on recombinantly expressed PfCCp proteins further demonstrated direct interactions of distinct PfCCp-domains. Especially the LCCL-, the SR- and the NEC-domain are involved in protein interactions within the PfCCp family supporting the hypothesis that protein complex formation during gametogenesis of the pathogen is mediated by the PfCCp family members. Transmission blocking assays will now elucidate the potential of select PfCCp proteins as subunits of TBV. Rising resistances against common available antimalaria drugs prompt the search for new targets for the treatment of the disease. Falcipain-2 and falcipain-3 are cysteine proteases of Plasmodium which play a pivotal role in hemoglobin hydrolysis and are putative targets for the development of new antimalarial drugs. In the present work a set of peptidomimetic 1,4-benzodiazepin derivatives and a set of non-peptidic etacrynic acid derivatives were evaluated for their antiplasmodial activity. Initial screening of the 1,4-benzodiazepin derivatives containing a vinyl sulfone warhead on recombinantly expressed falcipain-2 revealed irreversible inhibition of the enzyme. These compounds also exhibited antiplasmodial activity in vitro. Docking studies and HPLC-Assays using the etacrynic acid derivatives revealed inhibition of the cysteine protease papain and of the SARS coronavirus main protease Mpro. Further screening on recombinantly expressed falcipain-2 and falcipain-3 revealed inhibitory effects for some of these derivatives. In vitro testing on P. falciparum blood stages revealed weak antiplasmodial activity for flourine substituted etacrynic acid derivatives and for derivatives having a partially modified structure of etacrynic acid. The most promising inhibitor of the study has now been biotinylated for further affinity binding studies to evaluate its potential binding partners. Taken together both tested inhibitor classes exhibit inhibiting activity against cysteine proteases and therefore provide basis for the development of more effective new cysteine protease inhibitors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:3661 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Dude, Marie-Adrienne |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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