Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren führt in Abhängigkeit von der Signalstärke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen führt in Abhängigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch Überexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazelluläre Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende für das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine höhere Proteinstabilität auf. Die Fusion der letzten 35 Aminosäuren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 führte zu einem sehr instabilen chimären Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend für die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden über den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch für A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verlängert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only“ Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erhöht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschränken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilität sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion für das Protein vermittelt. / The strong stimulation of lymphocytes through their antigen receptors leads to the induction of apoptosis unless a costimulatory signal is provided. This process plays an important role in the negative selection of B-lymphocytes and can be mimicked in the immature murine lymphoma cell line WEHI 231. Engagement of the B-cell receptor (BCR) on WEHI 231 cells leads to apoptosis via a pathway that requires the processing of mitochondria-dependent caspase 9. This can be prevented by overexpression of the antiapoptotic Bcl-2 family member A1. In contrast to most Bcl-2 proteins, A1 does not contain a C-terminal region which recruits it to intracellular membranes of the mitochondria or endoplasmatic reticulum. The aim of this thesis was to investigate the function of the A1 C-terminus. Deleting the C-terminus increased the stability of A1 whereas fusing the last 35 amino acids of A1 onto an enzymatically-inactive caspase 3 mutant leads to a highly unstable chimeric protein. It therefore appears that the C-terminus is responsible for A1´s short half-life. Most short-lived proteins are degraded via the proteasomal pathway. It is likely A1 is also degraded via the proteasomal pathway, since its half-life was increased in the presence of a proteasomal inhibitor. Furthermore, coexpression studies showed a strong ubiquitylation of A1, which was greatly reduced in the stable truncated variant of A1. However, A1 is not always unstable. In the presence of the ”BH3-only“ protein Bim, a direct interaction partner of A1, the half-life of A1 was strongly increased. The antiapoptotic function of A1 can not just be mediated by the binding and neutralising of proapoptotic partners such as Bim because the C-terminal deletion mutant, which can also interact with Bim, fails to protect cells from etoposide-induced apoptosis. Taken together these results show that the Bcl-2 family member A1 has a very short half life and that the C-terminus is not only responsible for its rapid turnover but also for the antiapoptotic function of the protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1206 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Herold, Marco |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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