Introdução: A importância do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente enfatizada, particularmente nos pacientes com asma grave e de difícil controle. O óxido nítrico (NO) é um importante modulador da resposta contrátil, inflamatória e de remodelamento pulmonar que ocorrem na asma. Embora seu papel na modulação em vias aéreas proximais e distais já tenha sido estabelecido, seus efeitos no parênquima pulmonar foram pouco investigados. Objetivos: Avaliar se a inibição da arginase 2, por intermédio do tratamento com N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), e da iNOS, por intermédio da administração de 1400W, pode modular a resposta constritora de parênquima distal, o estresse oxidativo, a expressão de iNOS, assim como a atividade da arginase, em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. Métodos: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml- 4 semanas) e tratados com 1400W (2mg/Kg ip. diariamente) iniciando após a 7ª inalação e nor- NOHA (10M - infusão no banho durante a avaliação da mecânica oscilatória), ou associação de 1400W + nor-NOHA (administrado conforme descrito anteriormente). Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a foi realizada a avaliação da mecânica oscilatória do parênquima pulmonar, sendo obtidos os valores de resistência e elastância tecidual na condição basal e após desafio (0,1% de ovoalbumina). Em seguida, os fragmentos de tecido pulmonar periférico foram fixados em solução de formolaldeído a 4%, por 48 horas. Depois de terminada a fixação, o material foi submetido às técnicas histológicas habituais com parafina, para obtenção de cortes de 4m de espessura. Os cortes foram corados para Hematoxilina e Eosina e utilizando técnica de imunohistoquímica foram avaliados o número de células iNOS positivas, a expressão de PGF2, do fator de transcrição NF-kB e de arginase 2 no septo alveolar, por intermédio de avaliação morfométrica. A expressão de arginase 2, NF-kB e PGF2 nos fragmentos de tecido pulmonar periférico foram avaliados em aumento 400X utilizando o programa Image-Pro Plus 4.5v Image Analysis System e os resultados foram expressos em porcentagem. Em relação ao número de células iNOS positivas nos fragmentos pulmonares, foi utilizada a técnica de contagem de pontos, determinada pelo número de pontos que coincidiam em células positivas em cada campo dividido pelo número de pontos que incidiam no tecido pulmonar, no aumento de 1000x. Foram analisados 10 campos por corte, selecionados de forma randômica. Os resultados foram expressos como células por unidade de área (104m2). Para a avaliação da atividade da arginase 2, foi utilizado o método descrito no kit da BioAssay Systems que utiliza um cromogênio, que forma um complexo corado com uréia, produzido na reação de arginase. A determinação da atividade da arginase 2 envolveu a medida da velocidade de reação, expressa em termos de atividade por miligrama de proteína (U/mg). Resultados: Não houve alteração no percentual de estruturas (vasos, vias aéreas e tecido alveolar) no tecido pulmonar nos quatro grupos experimentais, sendo que mais de 90% de tecido do fragmento pulmonar foi constituído de alvéolos. Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (após desafio antigênico), no número de células iNOS positivas, na percentagem de expressão de PGF2, arginase 2 e NF-kB no septo alveolar, assim como da atividade de arginase 2 comparativamente aos grupos controles (p<0,001). O tratamento com nor-NOHA ou 1400W isoladamente em animais expostos à ovoalbumina atenuou a resposta de elastância e resistência teciduais após desafio antigênico (p<0,001), o número de células iNOS positivas (p<0,001), na expressão de PGF2, de arginase 2 e NF-kB no septo alveolar (p<0,001). Porém a atividade da arginase 2 só foi reduzida nos grupos que foram tratados com nor-NOHA e na associação de 1400W e nor-NOHA (p<0,05). A associação de 1400W e nor-NOHA em animais expostos à ovoalbumina potencializou a atenuação da expressão PGF2 no septo alveolar (p<0,001). Conclusões: O presente estudo sugere que, neste modelo experimental de inflamação crônica pulmonar, a inibição da arginase tem papel importante na modulação das repostas constritoras e de estresse oxidativo no parênquima pulmonar distal. A associação da inibição da iNOS à da arginase 2 potencializa o controle da resposta de estresse oxidativo. Estas respostas são, pelo menos em parte, moduladas pela ativação de NF-kB. A inibição destas vias enzimáticas pode representar uma estratégia futura para o tratamento de pacientes com asma grave e de difícil controle / Introduction: The importance of the lung parenchyma in the pathophysiology of asthma has recently been emphasized, particularly in patients with severe asthma and difficult to control. Nitric oxide (NO) is an important modulator of contractile response, lung inflammation and remodeling occurring in asthma. Although its role in the modulation proximal and distal airways tone control has already been established, its effects on the lung parenchyma were rarely investigated. Aims: To evaluate the inhibition of arginase 2, through treatment with N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) and / or iNOS, through the administration of 1400W, can modulate the constrictor response of distal parenchyma, oxidative stress, the expression of iNOS and the activity of arginase, in a model of chronic allergic lung inflammation in guinea pigs. Methods: The seven animals were exposed to inhaled saline or ovalbumin with increasing doses (1~5mg/ml-4 weeks) and treated with 1400W (2mg/kg ip daily) beginning after the 7th inhalation and nor-NOHA (10M - infusion in the bath during the evaluation of mechanical oscillation), or combination of 1400W + nor- NOHA (administered as formerly). Seventy-two hours after the seventh inhalation the animals were anesthetized, and exsanguinated and it was performed evaluation was made of oscillatory mechanics of lung parenchyma, and obtained the values of tissue resistance and elastance at baseline and after challenge (0.1% ovalbumin). Then the peripheral lung tissue fragments were fixed in formolaldeíde 4% for 48 hours. After completion of fixation, the material was subjected to routine histological techniques with paraffin to obtain sections of 4m thickness. The sections were stained with Hematoxylin and Eosin and by using immunohistochemical technique, we assessed the number of iNOS positive cells and expression of PGF2, of the transcription factor NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum, through morphometric analysis. The expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 in peripheral lung tissue fragments were evaluated at 400X increase by Image - Pro Plus Image Analysis System 4.5v and the results were obtained as a ratio between the amount of expression of arginase 2, NF-kB and PGF2 and are expressed as percentage. Regarding the content of iNOS in lung fragments, we used the technique of counting points, determined by the number of points coinciding in the positive cells in each field divided by the number of points that focused on lung tissue, using the increase of 1000x. Were increase of 10 fields analyzed per section, selected randomly. The results were expressed as cells per unit area (104m2). To assess the activity of arginase 2 we used the method bioassay described in the kit Systems using a chromogen which forms a colored complex with urea produced in the reaction of arginase. The determination of the activity of arginase 2 involved the measurement of reaction rate, expressed in terms of activity per milligram of protein (U/mg). Results: There were no changes in the percentages of structures (vessels, airways and alveolar tissue) lung tissue in four experimental groups, with more than 90% of the tissue fragment consisted of pulmonary alveoli. The animals that were exposed to ovalbumin, showed an increase in tissue resistance and elastance after antigen challenge, the number of iNOS positive cells, the of expression of PGF2, of NF-kB and arginase 2 in the alveolar septum well as in the activity of arginase 2, compared to control groups (p <0.001). The treatment with nor-NOHA or 1400W alone in animals exposed to ovalbumin attenuated the tissue elastance and resistance after antigenic challenge (p <0.001), the number of iNOS positive cells (p <0.001), the expression of PGF2, arginase 2 and NFkB in the alveolar septum (p<0.001). However the activity of arginase 2 was reduced in only in the groups that were treated with nor-NOHA and the association of 1400W and nor-NOHA (p <0.05). The combination of 1400W and nor-NOHA, in animals exposed to ovalbumin enhanced the attenuation of the expression of PGF2 in the alveolar septum (p <0.001). Conclusions: The present study suggests that in this experimental model of chronic pulmonary inflammation, inhibition of arginase 2 plays an important role in the modulation of constrictor responses and oxidative stress in the distal lung parenchyma. The association of iNOS inhibition to the arginase 2 enhances the control of oxidative stress response. These responses are, at least in part, modulated by the activation of NF-kB. The inhibition of these enzyme pathways may represent a future strategy for the treatment of patients with severe asthma and difficult to control
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31072012-113923 |
| Date | 18 June 2012 |
| Creators | Aristóteles, Luciana Ritha de Cassia Rolim Barbosa |
| Contributors | Tibério, Iolanda de Fátima Lopes Calvo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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