La homeostasis lipídica está regulada por factores de transcripción llamados Proteínas de unión a elementos de respuesta a esteroles ó SREBP. Estas porteínas activan a nivel transcripcional enzimas de las vías de síntesis de colesterol, ácidos grasos, triglicéridos y fosfolípidos. Además estos factores regulan la diferenciación adipocitaria y la expresión génica dependiente de insulina. Alteraciones funcionales en SREBP han sido relacionadas con el desarrollo de diversas patologías metabólicas humanas como la obesidad y la diabetes tipo 2. Existen tres miembros de la familia SREBP. Las variantes SREBP1a y SREBP1c, son producidas por splicing alternativo a partir de un único gen mientras que SREBP2 es codificada por un gen diferente. Las proteínas SREBP son sintetizadas como precursores inactivos anclados a la membrana del retículo endoplásmico. En condiciones de bajos niveles de esteroles, los precursores inactivos son transportados hasta el aparato de Golgi donde son activados mediante cascada proteolítica liberando la proteína nuclear activa. El precursor inactivo permanece anclado en el retículo debido a su interacción con otras dos proteínas de membrana: SCAP e INSIG (insulin-induced gene), ambas reguladas por esteroles. Se conocen dos isoformas de INSIG denominadas INSIG1 e INSIG2. En humanos, ambas proteínas tienen un 59% de homología y difieren principalmente en su forma de regulación. En ratones se han encontrado dos variantes de RNA mensajero de INSIG2 denominadas INSIG2a, específica de hígado y regulada negativamente por insulina, e INSIG2b, de expresión ubicua. Teniendo en cuenta que variaciones en la expresión de las proteínas SREBP se han relacionado con enfermedades complejas, así como la importancia que se está dando a las regiones reguladoras en la etiopatogenia de estas enfermedades, el objetivo de esta tesis ha sido caracterizar la regulación a nivel transcripcional de la vía SREBP con tres objetivos concretos: 1, caracterización del Promotor humano SREBP1a, 2, caracterización del Promotor humano SREBP1c, y 3, identificación del Promotor humano INSIG2.El estudio del promotor humano SREBP1a nos permitió identificar la región correspondiente al promotor proximal. Este promotor, al igual que el promotor murino, está comprendido en una pequeña zona del DNA de 75pb que se caracteriza por una región rica en GC. Esta región contiene 3 sitios superpuestos SP1/EGR1 capaces de unir ambos factores de transcripción tanto in vitro como in vivo, siendo SP1 un activador de la transcripción y EGR1 un inhibidor de su actividadHemos estudiado también la regulación del promotor humano SREBP1c tanto a nivel basal como la respuesta a factores nutricionales. Nuestros resultados demuestran que la regulación de los promotores de ambas especies presenta gran similitud. Los estudios realizados in vivo demostraron además que el receptor nuclear PPAR es capaz de unirse al promotor en presencia de RXR y que tanto el promotor SREBP1c humano como el de rata son activados por un agonista de este receptor. El cofactor PGC1 está también involucrado en la regulación de este promotor.Hemos clonado y caracterizado la región proximal del promotor humano INSIG2. Los resultados obtenidos demuestran por primera vez que proteínas de la familia de factores de transcripción Ets están involucradas en la regulación de este promotor. Se ha identificado la acción de la proteína SAP1a que controla su actividad basal en forma dependiente de su estado de fosforilación. Este promotor está además regulado por insulina en forma positiva. Este estudio funcional y estructural de los promotores humanos de SREBP1 y su regulador INSIG2 nos ha permitido delinear parte de la regulación trancripcional de la vía SREBP, así como similitudes y diferencias entre especies. Esta información nos permitirá analizar las alteraciones que puedan tener relevancia fisiológica así como los mecanismos indispensables para la correcta funcionalidad de estas vías metabólicas. / ABSTRACSterol regulatory-element-binding proteins (SREBPs) are transcription factors with a central role in cholesterol and fatty acid metabolism. Functional alterations in these proteins have been implicated in the development of several human metabolic diseases such as obesity or type 2 diabetes. The SREBP family of transcription factors consists of three isoforms, SREBP1a and 1c, encoded by a unique gene by alternative splicing, and SREBP2 encoded by a separate gene. SREBPs are synthesized as inactive precursors embedded in ER membranes until they are transported to the Golgi apparatus where they are activated by proteolysis. The ER-to-Golgi migration of SREBPs is crucially dependent on its interaction with two other membrane proteins: SCAP (SREBP cleavage-activating protein) and INSIG (insulin-induced gene), both regulated by cell sterol levels. Two INSIG isoforms are known, designated INSIG1 and INSIG2. In humans, both proteins are 59% identical but they differ in their mode of regulation. Transcription of INSIG2 gene in mice give rise to alternative mRNA transcripts named INSIG2a which is liver specific and INSIG2b. In the present work we aimed to analyze the transcripcional regulation of the SREBP pathway focusing on the characterization of the functional al structural organization of SREBP1a, SREBP1c and INSG2 human promoters.Human SREBP1a promoter is characterized by three GC boxes responsible for its SP1 activation and EGR1 inactivation. Human SREBP1c is regulated by nutricional factors in a similar way as the mouse and rat promoter. A response mediated by PPAR nuclear receptor and its coactivator PGC1 is present in rat and human promoter. INSIG2 transcriptional regulation has not been previously studied. Human INSIG2 promoter was identified and cloned for analysis. The proximal promoter is comprised in a 300 pb fragment. The results show this region is regulated by Ets family of transcriptional factors with a particular participation of phosphorilated Sap1a protein. Human promoter is also positively regulated by insulin in primary culture hepatocytes.This study on human promoters of SREBP1 and INSIG2 allowed us to delineate part of the transcriptional regulation of SREBP pathway wich would be of great relevance for the analysis of physiologically relevant alterations related with metabolic pathology.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/9562 |
| Date | 04 July 2009 |
| Creators | Fernández Álvarez, Ana Julia |
| Contributors | Casado Pinna, Marta, Universitat de València. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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