A descoberta da osteocalcina, uma proteína sintetizada por osteoblastos, como hormônio com efeitos positivos na resistência à insulina contribuiu para conceituar o osso como órgão endócrino. Pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares de atuação da osteocalcina sobre o quadro de melhora de resistência à insulina, sendo assim o presente projeto teve o objetivo de desvendar alguns mecanismos moleculares da ação de osteocalcina na resistência à insulina e inflamação em camundongos obesos, e em adipócitos 3T3-L1. Camundongos controles, obesos tratados com solução salina e obesos tratados com osteocalcina não carboxilada foram submetidos aos testes de tolerância à insulina, ao piruvato e ao ensaio de sinalização da insulina in vivo, à coleta de sangue (análises bioquímicas e metabólicas), de tecido adiposo branco (TAB), de fígado e de fêmur. Os efeitos da osteocalcina não carboxilada na resistência à insulina e inflamação foram avaliados em adipócitos da linhagem 3T3-L1 desafiados com TNF-a. O conteúdo de mRNA foi analisado por PCR quantitativo e de proteína, por Western blotting. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com osteocalcina não carboxilada melhora a sensibilidade à insulina in vivo em camundongos obesos. No tecido adiposo branco (TAB), a osteocalcina teve efeitos positivos como a redução na massa do TAB periepididimal, o aumento a expressão do gene Slc2a4 e o conteúdo proteico de GLUT4, melhora na fosforilação de AKT estimulada pela sinalização da insulina, além de reduzir a expressão de genes relacionados à inflamação e à maquinaria transcricional do inflamassomo e reduzir focos inflamatórios caracterizados pela ausência de coroas de macrófagos. Em adipócitos 3T3-L1 desafiados com TNF-a, a osteocalcina recuperou o conteúdo de Slc2a4/GLUT4 e reduziu a expressão de genes inflamatórios, além de que o tratamento com osteocalcina aumentou a fosforilação de AKT induzida pela insulina. No fígado, a osteocalcina aumentou a sensibilidade à insulina e aumentou a fosforilação de AKT induzida pela insulina in vivo e reduziu a expressão de mRNA de Tnfa, sem alterar a expressão da proteína GLUT2 e de seu respectivo gene. No osso, a osteocalcina melhorou a resistência a insulina por favorecer a fosforilação de AKT induzida pela sinalização da insulina e por reduzir a expressão de genes envolvidos na resistência à insulina, resultando no aumento da secreção de osteocalcina não carboxilada na circulação. Em conclusão, conseguiu-se demonstrar alguns mecanismos de ação da osteocalcina na melhora do quadro de resistência à insulina na obesidade, em que no TAB a osteocalcina melhora a resistência à insulina por diminuir a inflamação e aumentar a sinalização da insulina e a expressão de Slc2a4/GLUT4; no fígado, a osteocalcina melhorou a sinalização insulínica e reduziu a expressão de Tnfa; e no osso a osteocalcina aumentou a secreção de osteocalcina não carboxilada por melhorar a resistência à insulina. / The discovery of osteocalcin, a protein synthetized by osteoblasts, as a hormone that has positive effects on insulin resistance, contributed to support the concept of bone as an endocrine organ. However, very little is known about the molecular pathways involved in osteocalcin improved-insulin resistance. The presente study aimed to investigate the mechanisms of action of osteocalcin on insulin resistance and inammation in obese mice and 3T3-L1 adipocytes. Lean control, saline-treated obese and uncarboxylated osteocalcin (uOC)-treated obese mice were subjected to insulin and pyruvate tolerance test and insulin signaling assessment in vivo. Blood was collect for biochemical/metabolic prole analysis; and, liver, skeletal muscle, white adipose tissue(WAT) and bone were collected for protein (Western blotting) and mRNA (RT-qPCR) analysis. uOC effects on insulin resistance and inammation were also investigated in 3T3-L1 adipocytes challenged with tumor necrosis factor. Osteocalcin treatment improved in vivo insulin resistance in obese mice. In WAT, osteocalcin had positive effects such as WAT weight reduction; upregulation of glucose transporter (GLUT4) protein and its mRNA (Slc2a4); improved insulin-induced AKT phosphorylation; downregulation of several genes involved in inammation and inammassome transcriptional machinery, and reduction of the density of macrophage in crown-like structures (histomorphometrical analysis). Notably, in 3T3-L1 adipocytes, osteocalcin restored Slc2a4/GLUT4 content and reduced the expression of inammatory genes after TNF-a challenge; moreover, osteocalcin treatment increased AKT phosphorylation induced by insulin. In liver, osteocalcin treatment improved insulin resistance and increased AKT phosphorylation induced by insulin, and reduced the expression of Tnfa, not changing the expression of glucose transporter (GLUT2) protein and its mRNA (Slc2a2). Finally, it was observed that in bone, osteocalcin improves insulin resistance by increasing insulin-induced AKT phosphorylation and reducing the expression of genes involved in bone insulin resistance, resulting in increased secretion of uncarboxylated osteocalcin in circulation. We provided some mechanisms of action for osteocalcin in the amelioration of insulin resistance in obesity: in WAT, osteocalcin improves insulin resistance by decreasing inammation, and increasing insulin signaling and the expression of Slc2a4/GLUT4; in liver, the osteocalcin improved insulin resistance and reduced Tnfa expression; and, in bone, osteocalcin increases the secretion of uncarboxylated osteocalcin by improving insulin resistance.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22032019-165554 |
| Date | 16 October 2018 |
| Creators | Guedes, Jose Augusto Cipriano |
| Contributors | Furuya, Daniela Tomie |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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