Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellulären Produktion von cGMP über den membranständigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkanälen Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass ANP über GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabhängige Weise stimuliert. Um eine mögliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpräzipitation mit einem anti-Flag-Antikörper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabhängig von ANP mit GC-A ko-immunpräzipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Domäne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer Überproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antikörper die Koimmunpräzipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgeführt, um die lokale Nähe von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine mögliche ANP-induzierte Konformationsänderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen führte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabhängig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP führte dagegen zu keiner Veränderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der für den neuen cGMP-unabhängigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A für die Insulinausschüttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans’schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP für die systemische Glukose-Homöostase zu ergründen, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans’schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht möglich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressionsänderung von GC-A in anderen Geweben führte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO Mäuse blieb unauffällig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP für die Insulinausschüttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere für 12 Wochen einer fettreichen Ernährung (60% Fett) ausgesetzt um einen Prädiabetes auszulösen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgeführt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der Nüchternglukosewert in den weiblichen KO-Mäusen leicht erhöht ist. Daher wurden die oGTT‘s in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle Mäuse eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60% erhöht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und für immunhistologische Zwecke präpariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergrößerte durchschnittliche Inselfläche und eine erhöhte durchschnittliche β-Zellfläche der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen führt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Prädiabetes beiträgt. Eine mögliche verstärkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell könnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems für die Insulinausschüttung näher ergründen und dadurch eventuell neue Therapieansätze für Diabetes mellitus Typ 2 bringen. / Atrial natriuretic peptide (ANP) modulates blood pressure and volume by its cGMP generating guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. ANP also stimulates cardiomyocyte growth and angiogenesis. This work concentrates on two separate mechanisms where ANP/GC-A system plays an important role. The first part of this work concerns the dynamic interaction of the transient receptor potential canonical type 3 or type 6 (TRPC3/C6) cation channels with GC-A receptor. Recently, it was indicated that ANP via GC-A stimulates the TRPC-mediated Ca2+ influx in cardiomyocytes in a cGMP-independent manner. To analyze the presumed direct interaction between TRPC3/C6 and GC-A the proteins TRPC3 or C6 and Flag-GC-A were coexpressed in HEK293 cells in presence or absence of ANP. After lysis GC-A was precipitated from the membrane fraction of the cells with anti-Flag-antibodies. TRPC3 and TRPC6 were detected in this fraction. The co-immunoprecipitation was also performed with a modified GC-A receptor lacking the cyclase domain as well as with cardiomyocytes from transgenic mice characterized by cardiomyocyte overexpression of HA-GC-A. In all cases TRPC3/C6 co-immunoprecipitated with GC-A. Finally, FRET-based approaches were used to examine the local distance between GC-A and TRPC3. Coexpression of GC-A-CFP and TRPC3-YFP in HEK293 cells led to a FRET signal which was decreased by ANP (1-100 nM) in a concentration dependent manner. Incubation of the membrane permeable cGMP analog 8-Br-cGMP did not alter the FRET signal. All results confirm the presence of a stable protein interaction between GC-A and TRPC3 or TRPC6. In the second part of this work the role of ANP/GC-A system for (patho)physiologic insulin release in pancreatic β-cells was investigated. It was recently shown that GC-A is expressed in β-cells and that ANP modulates β-cell growth and insulin secretion in isolated pancreatic islets. To analyze the relevance of ANP for the systemic glucose homeostasis a new mouse model was generated characterized by a β-cell-specific GC-A deletion. To prove the conditional GC-A knock out (KO) we used genomic PCR and immunohistochemistral approaches. The specific deletion did alter neither the GC-A expression in other tissues nor blood pressure and heart weight in KO mice. Fasting blood glucose levels were slightly elevated in female KO mice. Therefore all subsequent experiments were evaluated gender-related. Male and female controls and KO mice were fed a high fat diet (60 % fat) for 12 weeks to provoke a prediabetic state and insulin resistance. Oral glucose tolerance tests (oGTT), blood pressure measurements and weight analysis were performed to analyze if the KO affects insulin homeostasis under pathophysiological conditions. All mice developed an insufficient blood glucose regulation which was evident using the oGTT. Blood pressure was increased by 60% both in controls and KO mice. For immunohistochemical studies the pankreata from several animals were dissected and fixed in formalin. The cut organ slices were treated with glucagon and insulin antibodies. All islets were documented and analyzed morphometrically. The mean islet area and the mean β-cell area was significantly increased in KO animals. In summary, the β-cell-specific KO of GC-A led to hypertrophic β-cells under pathophysiological conditions. To uncover the entire role of ANP/GC-A system for the insulin release further studies have to be performed. The new mouse model provides the potential to find new therapeutic strategies for the treatment diabetes mellitus type 2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:6687 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Dankworth, Beatrice |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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