La pression rencontrée par les organismes sur Terre varie de la pression atmosphérique à 110 MPa atteinte dans la fosse la plus profonde de l'océan. Même si Escherichia. coli n’est pas naturellement résistante à la pression, elle capable d'acquérir une résistance et même supporter un choc de pression de 2 GPa (~20 000 atm). L'une des réponses intéressantes d’E. coli à un choc sous létal de pression (100 MPa) est l'induction d'une réponse SOS dépendante de RecA due à des lésions double brins de l’ADN. La pression elle-même n'est pas capable de compromettre l'intégrité covalente de l'ADN. Des criblages ont permis d’isoler des souches d’E. coli résistantes à la pression qui révèlent qu'une endonucléase de restriction (ER) de type IV, Mrr, est le seul facteur responsable du clivage de l'ADN. Cette enzyme cible uniquement l'ADN méthylé et l’expression d’une MTase étrangère, M.HhaII, est également capable d'induire une réponse SOS dans des souches de E. coli en présence de Mrr. Ici, nous démontrons en utilisant des techniques de fluctuations d’intensité de fluorescence, in vivo et in vitro que Mrr est un présent sous la forme d’un tétramère dans les cellules non stressées. La pression est capable de dissocier Mrr en dimères actifs qui peuvent lier l'ADN et cliver à certains sites cryptiques. En revanche, la MTase HhaII favorise la forme dimeric de Mrr liée à l’ADN en raison de la méthylation de nombreux sites de haute affinité. Une analyse mutationnelle et un modèle d’homologie 3D de la protéine entière révèle la base structurelle probable du changement entre la forme tétramérique inactive à la forme dimérique active. Nous avons mis en pace un système permettant de faire de la microscopie sous pression (in vitro and in vivo) et nos résultats préliminaires ont confirmé notre modèle d’activation de Mrr. / The pressure encountered by organisms on Earth varies from the atmospheric pressure to 110 MPa as reached in the deepest trench of the ocean. Although Escherichia coli is not naturally resistant to high pressure, it is capable of acquiring pressure resistance and withstanding a pressure shock up to 2 GPa (~20,000 atm). When exposed to a sub-lethal pressure shock (100 MPa) E. coli induces a RecA-dependent SOS response due to DNA double strand breaks. Pressure itself is not capable of compromising the covalent integrity of the DNA. Instead, screens for pressure-resistance E. coli mutants have revealed that a Type IV restriction endonuclease, Mrr is the only factor responsible for DNA cleavage. This enzymes targets only methylated DNA and expression of a foreign methyltransferase, M.HhaII, is also capable of inducing an SOS response in strains harboring Mrr. Here, we demonstrate using fluorescence fluctuation techniques in vivo and in vitro that Mrr is present as a tetramer in unstressed cells and that pressure dissociates Mrr into active dimers that can bind DNA and cleave at some cryptic sites. In contrast, the M.HhaII MTase pulls the Mrr tetramer-dimer equilibrium to the dimer-bound DNA form probably due to the methylation of many high-affinity sites. Mutational analysis associated with a 3D homology model of the full-length protein reveals the probable structural basis for the switch from an inactive tetramer to an active dimer. We set up a system that allows microscopy experiments (in vitro and in vivo) under pressure and preliminary results have confirmed our model of Mrr activation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018MONTT051 |
| Date | 28 September 2018 |
| Creators | Bourges, Anaïs |
| Contributors | Montpellier, Declerck, Nathalie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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