Using ion pair chromatography, separation and analysis of shorter mRNA fragments was possible. The aim of the study was to develop a separation method for quantitation of 5’capped versus uncapped mRNA. Cleavage of mRNA was performed by complementary probes and the enzyme RNase H which created shorter mRNA fragments containing the 5’ end. During this study, several separation methods have been tested where the amount organic solvent proved to be a crucial factor for elution of the fragments. To identify the peaks during the method development, LC-MS had to be used which resulted in an adjustment of the methods parameters. With the mass spectrometric analyses could a capped fragment as well as a capped fragment containing an extra guanine nucleotide be identified, however, there was no presence of the uncapped fragment. Enzymatic protocols have been investigated where the purpose was to create uncapped RNA fragments to be used as a reference. A minor validation of the final separation method has been carried out where the generated data can be used to establish acceptable system suitability test criteria for separation methods when analyzing mRNA drug products. / Genom användandet av jonparskromatografi var separation och analys av kortare mRNA fragment möjlig. Syftet med studien var att sätta upp en kvantifieringsmetod för analys av förhållandet 5’cappat kontra icke-cappat mRNA. Klyvning skedde med hjälp av en komplementär probe och enzymet RNase H som skapade korta mRNA fragment innehållande cap strukturen. Under studiens gång har flertalet separationsmetoder testats, där halt organiskt lösningsmedel var en viktig faktor för eluering. För att identifiera topparna behövdes masspektrometri användas vilket resulterade i en justering av metodens parametrar. Med hjälp av LC-MS kunde det cappade fragmentet detekteras, dock fanns ingen närvaro av ett icke-cappat mRNA. Enzymatiska undersökningar har utförts där målet var att skapa icke-cappat RNA för att använda som referens. En mindre validering av den finala separationsmetoden har genomfört där de genererade datavärdena sedan kan användas för att fastställa accepterbara kriterier för separationsmetoder vid analys av läkemedelsprodukter baserade på mRNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kau-95728 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Lindström, Felicia |
| Publisher | Karlstads universitet, Institutionen för ingenjörs- och kemivetenskaper (from 2013) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0015 seconds