The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood.
The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far.
Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation.
A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function. / Das molekulare Chaperon Hsp90 ermöglicht die korrekte Faltung und Aktivierung eines breiten Spektrums an strukturell und funktionell unterschiedlichen Klienten-Proteinen. Hsp90 bildet einen zentralen Knotenpunkt der Protein-Homöostase und ist an der Entstehung einer Vielzahl von humanen Erkrankungen beteiligt. Trotz des vielversprechenden Potentials, das Hsp90 als Zielprotein für die Behandlung von Erkrankungen besitzt, ist der Mechanismus, durch den Hsp90 seinen Klienten erkennt und dessen Reifung gewährt, noch unbekannt,
Die Gestalt des homodimeren Proteins ähnelt einer molekularen Klammer, die sich durch Bindung und Hydrolyse von ATP öffnet und schließt. Strukturelle Studien zeigen ein Netzwerk an weit voneinander entfernt liegenden lokalen Konformationsänderungen, die den langsamen Übergang (im Bereich von Minuten) in die Hydrolyse-aktive, geschlossene Konfiguration koordinieren. Allerdings sind die Kinetiken der lokalen Konformationsänderungen unbekannt, da es bisher noch keine spektroskopische Methode gibt, die diese detektieren könnte.
Die natürliche Aminosäure Tryptophan kann durch eine photoinduzierte-Elektronentransfer-(PET)-Reaktion die Fluoreszenz extrinsischer Fluorophore löschen. Fluorophor und Tryptophan müssen hierfür in einer Kontakt-Distanz im sub-nanometer Bereich stehen. Dieser Lösch-Mechanismus wurde zu einem 1-nm sensitiven, spektroskopischen Werkzeug entwickelt, das für die Detektion schneller Proteinfaltungsdynamiken angewendet werden kann. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation wurden PET-Reporter-Systeme entworfen. Diese dienten der Untersuchung lokaler Konformationsänderungen, die Teil des mechanistischen Kerns des Hsp90-Chaperon-Zyklus sind. ATP-induzierte Kinetiken des ATP-Lid Schlusses sowie des Untereinheiten-Wechsels des N-terminalen ß-Faltblatts als auch der Assoziation der N-terminalen mit der mittleren Domäne wurden ermittelt. In Ensemble Experimenten konnte gezeigt werden, dass lokale Bewegungen auf ähnlichen Zeitskalen stattfinden und in guter Übereinstimmung mit der ATP-Hydrolyserate sind. Durch die Anwendung von Funktionsmutanten konnte demonstriert werden, dass die lokalen Bewegungen zusammenwirkend geschehen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Lid anhand eines zweistufigen Prozesses schließt. Dieser besteht aus einer, durch die Bindung von ATP ausgelösten, raschen Lid-Rekonfiguration, gefolgt von der langsamen Schließung des Lids. Das Co-Chaperon Aha1 scheint den ATPase-Zyklus bereits in einem frühen Stadium, durch die Remodellierung der Lid-Konformation und die Stabilisierung des apo-Hsp90 in einer vor-assoziierten Konformation der NM-Domänen, zu beeinflussen
Des Weiteren wurde eine Zwei-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie-Methode entwickelt, die es ermöglicht lokale Bewegungen an entfernten Positionen simultan und in Echtzeit zu beobachten. Dadurch kann festgestellt werden, ob eine Richtungscharakteristik innerhalb des Netzwerks lokaler Konformationsänderungen besteht. Hierfür wurde zunächst anhand von einfach markierten Hsp90 Konstrukten, die nur eine Bewegung darstellen, getestet ob die Detektion von PET-Komplexen auf der Einzelmoleküloberfläche möglich ist (Ein-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie). Die Fluoreszenz PET-gelöschter Komplexe konnte mittels Oxidation durch molekularen Sauerstoff wiederhergestellt werden, wodurch eine Unterscheidung zu photogebleichten Fluorophoren möglich war. In Zwei-Farben-Experimenten konnte zudem ein gedimmter Zustand der PET-gelöschten Fluorophore festgestellt werden, allerdings nicht für jedes der verwendeten PET-Reportersysteme. Die Ergebnisse deuten auf ein innerhalb der Zeitauflösung des Experiments (0.3 sec) gleichzeitiges Auftreten der lokalen Bewegungen hin. Des Weiteren scheint der Mechanismus des Klammerschlusses komplexer zu sein, als der Mechanismus der Klammeröffnung. Während die Kinetiken der Klammeröffnung durch eine mono-exponentielle Fit-funktion angepasst werden konnten, benötigte der Klammerschluss eine bi-exponentielle Anpassungsfunktion.
Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:16215 |
Date | January 2020 |
Creators | Schulze, Andrea |
Source Sets | University of Würzburg |
Language | English |
Detected Language | English |
Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
Format | application/pdf |
Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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