Gelenkknorpel ist ein gefäßloses, hoch spezialisiertes Gewebe mit nur sehr begrenzter Regenerationsfähigkeit. Entstandene Läsionen werden bei natürlicher Heilung durch min-derwertigen Faserknorpel gefüllt. Ein vielversprechender Therapieansatz kommt aus dem Gebiet des Tissue Engineering. Dabei werden isolierte Chondrozyten in vitro vermehrt und anschließend in den Defekt eingebracht. In den letzten Jahren ist hier die 3 D-Kultivierung in patientenspezifischen Biomaterialien zunehmend in den Fokus der Forschung geraten. Ziel der hier vorgestellten Studie war es, die Tauglichkeit von Vollblut und Blutplasma als Aus-gangsmaterial für MACTs aufgrund makroskopischer Eigenschaften, Zellzahlentwicklung im Konstrukt, Zellvitalität und Syntheseleistung charakteristischer EZM-Marker zu untersuchen.
Es wurde für diese Studie Knorpel aus den Fesselgelenken vier geschlachteter Pferde (2-16 Jahre) entnommen, mechanisch zerkleinert und anschließend mit Kollagenase A verdaut. Von einem 6 jährigen klinikeigenen Wallach wurde Vollblut in Citratröhrchen gewonnen, ein Teil zu Plasma weiterverarbeitet und beides bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung Schock gefroren. Zur Herstellung der walzenförmigen Konstrukte mit den Maßen 9,6 cm2 x 4,7 mm, wurden 4,5 ml Vollblut bzw. Plasma mit je 3x106 Chondrozyten suspensiert und durch Zuga-be von CaCl2 zur Koagulation gebracht. Der Kultivierungszeitraum betrug 28 Tage in DMEM, angereichert mit 10% allogenem Serum und 1% Antibiotika. Die Konstrukte wurden an den Tagen 1, 14 und 28 auf Zellzahl, -vitalität und mithilfe qRT-PCR auf hyaline Knorpelmarker wie Kollagen Typ II und Aggrekan untersucht. Zudem wurden histologische und immunhisto-chemische Präparate der Konstrukte angefertigt.
Die Zellvitalität betrug sowohl in den VB-, als auch in den BP-Konstrukten ≥95% bei steigen-der Zellzahl (bis zu 5x106 im Vollblutkonstrukt). Die MACTs beider Ausgangsmaterialien schrumpften auf eine Größe von 2 cm² x 2 mm. Histologisch konnten in beiden Konstruktar-ten mit der Alzianblaufärbung sGAG belegt werden. Darüber hinaus wurde der sGAG Gehalt mit dem DMMB Assay quantitativ ermittelt. Aggrekan, C-4-S, C-6-S und COMP wurden als wichtige Bestandteile der EZM immunhistochemisch angefärbt und waren ebenfalls in beiden Konstruktarten nachweisbar. Mit der qRT PCR konnte die Genexpression von Aggrekan, Kol II und Kol I über den zeitlichen Verlauf ermittelt werden. Es stellte sich heraus, dass sich sowohl die Genexpression von Aggrekan als auch die von Kol II, den beiden Indikatorprotei-nen EZMs des hyalinen Gelenkknorpels über den Kultivierungszeitraum absenkten. Dies deutet auf eine Dedifferenzierung der Chondrozyten hin. Die Expression von Kol I dagegen stieg um ein Vielfaches an. Auch das kennzeichnet eine Dedifferenzierung. Zieht man ande-re Studien heran, so ist die festgestellte Umstellung der Genexpression aber vergleichsweise niedrig, eine Dedifferenzierung weg vom chondrogenen Phänotyp in der hier vorliegenden Arbeit also weniger stark ausgebildet.
Biokompatibilität mit und Abbaubarkeit im Empfängerorganismus konnten in dieser in vitro Untersuchung nicht evaluiert werden.
Zusammenfassend kann man festhalten, dass VB und BP als Ausgangsbiomaterialien zur Herstellung von MACT geeignet sind. Inwieweit es gelingen wird, den chondrogenen Phäno-typ beispielweise durch mechanische Stimulation der eingesäten Zellen stärker zu erhalten, muss in folgenden Studien geklärt werden. Ebenfalls weiterer Forschungsbedarf ist bei den Eigenschaften Elastizität und Steifheit gegeben. Grundsätzlich gilt, dass MACTs auf VB- und BP-Basis einen einfachen, kostengünstigen und patientenspezifisch herstellbaren Therapie-ansatz für die Behandlung von Knorpeldefekten darstellen. / Articular cartilage is a vessel-free, highly specialized tissue with only very limited regenera-tive capacity. Resulting lesions are filled with inferior fibrocartilage by natural healing. A promising therapeutic approach comes from the field of tissue engineering. Therefore iso-lated chondrocytes are expanded in vitro and then placed into the defect. In the last few years the 3-D culturing in patient-specific biomaterials has come increasingly into the focus of research. Purpose of the present study was to evaluate the suitability of whole blood and blood plasma as a basic material for MACT based on macroscopic properties, development of cell number in the construct, cell viability and synthetic performance of characteristic markers.
For this study cartilage from the four fetlock joints of slaughtered horses (2-16 years) were removed, crushed mechanically and then digested with Collagenase A. Whole blood was obtained in citrate tubes of a 6 year old gelding owned by the clinic, finished part to both plasma and shock frozen at -80°C until further use. To prepare the cylindrical constructs, measuring 9.6 cm2 x 4.7 mm, 4.5 ml of whole blood or plasma, each with 3x106 chondro-cytes were suspended and coagulated by the addition of CaCl2. The cultivation period was 28 days in DMEM supplemented with 10% allogenic serum and 1% antibiotics. The con-structs were evaluated on days 1, 14 and 28 on cell number, viability, and using qRT-PCR examination for hyaline cartilage markers such as collagen type II and aggrecan. In addition, histological and immunohistochemical preparations of the constructs were made.
The cell vitality was in the WB, as well as in the BP constructs ≥ 95% with increasing cell number (up to 5x106 in whole blood construct). The MACTs of both basic materials shrink to a size of 2 cm x 2 mm². Histologically sGAG could be verified in both construct species by Alzianblau staining. In addition, the GAG content was determined with the DMMB assay quantitatively. Aggrecan, chondroitin-4-sulphate, chondroitin-6-sulphate and COMP as major components of the ECM were stained immunohistochemically and were also detectable in both types of constructs. Aggrecan, collagen II and collagen I were determined on the time course by qRT PCR gene expression. It turned out that the gene expressions of both, aggre-can and of collagen II, the two ECM protein indicators of hyaline cartilage lowered over the cultivation period. This indicates a dedifferentiation of chondrocytes. The expression of colla-gen I on the other hand increased to a multiple, also featuring a dedifferentiation. If one approached other studies, the observed change in gene expression is comparatively low. In the present work the dedifferentiation from the chondrogenic phenotype is less distinctive.
Biocompatibility and biodegradability in the recipient organism could not be evaluated in this in vitro investigation.
In summary, one should notice that VB and BP are suitable basic materials for the production of MACT. It has to be clarified by following studies, to what extent the chondrogenic pheno-type can be strengthened, for example by mechanical stimulation of cells sown. Also further research is needed on the given properties, e.g. elasticity and stiffness. Generally MACT based on WB and BP- is a simple, inexpensive and patient-specific produced therapeutic approach for the treatment of cartilage defects.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-89221 |
| Date | 22 June 2012 |
| Creators | Graf, Sophie Christine |
| Contributors | Veterinärmedizinische Fakultät, Chirurgische Tierklinik, Professor Dr. vet. med Walter Brehm, Professor Dr. med. Augustinus Bader, Professor Dr. vet.med. Walter Brehm, PD Dr. rer. nat. Cornelia Kasper |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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