Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. / Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:4875 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Götz, Andreas |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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