More and more newly registered drugs are proteins. Although many of them suffer from instabilities in aqueous media, the most common way of protein drug administration still is the injection of a solution. Numerous protein drugs require frequent administration, but suitable controlled release systems for proteins are rare. Chapter 1 presents current advances in the field of controlled delivery of particulate protein formulations. While the main focus lies on batch crystallized proteins, amorphous particulate proteins are also discussed in this work. The reason is that, on the one hand precipitated protein particles hold some of the advantages of crystalline proteins and on the other hand the physical state of the protein may simply be unknown for many drug delivery systems or semi-crystalline particles have been used. Crystallization and precipitations methods as well as controlled delivery methods with and without encapsulation in a polymeric delivery system are summarized and critically discussed.
In chapter 2 a novel way of protein crystal encapsulation by electrospinning is introduced. Electrospinning of proteins has been shown to be challenging via the use of organic solvents, frequently resulting in protein unfolding or aggregation. Encapsulation of protein crystals represents an attractive but largely unexplored alternative to established protein encapsulation techniques because of increased thermodynamic stability and improved solvent resistance of the crystalline state. We herein explore the electrospinning of protein crystal suspensions and establish basic design principles for this novel type of protein delivery system. Poly-ε-caprolactone (PCL) is an excellent polymer for electrospinning and matrix-controlled drug delivery combining optimal processability and good biocompatibility. PCL was deployed as a matrix, and lysozyme was used as a crystallizing model protein. By rational combination of lysozyme crystals with a diameter of 0.7 or 2.1 μm and a PCL fiber diameter between 1.6 and 10 μm, release within the first 24 h could be varied between approximately 10 and 100%. Lysozyme loading of PCL microfibers between 0.5 and 5% was achieved without affecting processability. While relative release was unaffected by loading percentage, the amount of lysozyme released could be tailored. PCL was blended with poly(ethylene glycol) and poly(lactic-co-glycolic acid) to further modify the release rate. Under optimized conditions, an almost constant lysozyme release over 11 weeks was achieved.
Chapter 3 takes on the findings made in chapter 2 and further modifies the properties of the nonwovens as protein crystal delivery system. Nonwoven scaffolds consisting of poly-ε-caprolactone (PCL), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and polidocanol (PD), and loaded with lysozyme crystals were prepared by electrospinning. The composition of the matrix was varied and the effect of PD content in binary mixtures, and of PD and PLGA content in ternary mixtures regarding processability, fiber morphology, water sorption, swelling and drug release was studied. Binary PCL/PD blend nonwovens showed a PD-dependent increase in swelling of up to 30% and of lysozyme burst release of up to 45% associated with changes of the fiber morphology. Furthermore, addition of free PD to the release medium resulted in a significant increase of lysozyme burst release from pure PCL nonwovens from approximately 2% to 35%. Using ternary PCL/PD/PLGA blends, matrix degradation could be significantly improved over PCL/PD blends, resulting in a biphasic release of lysozyme with constant release over 9 weeks, followed by constant release with a reduced rate over additional 4 weeks. Based on these results, protein release from PCL scaffolds is improved by blending with PD due to improved lysozyme desorption from the polymer surface and PD-dependent matrix swelling.
Chapter 4 gives deeper insight on lysozyme batch crystallization and shows the influences of the temperature on the precipitation excipients. Yet up to now protein crystallization in a pharmaceutical useful scale displays a challenge with crystal size and purity being important but difficult to control parameters. Some of these influences are being discussed here and a detailed description of crystallization methods and the achieved crystals are demonstrated.
Therapeutic use of such protein crystals may require further modification of the protein release rate through encapsulation. Silk fibroin (SF) harvested from the cocoons of Bombyx mori is a well-established protein suitable for encapsulation of small molecules as well as proteins for controlled drug delivery. This novel polymer was deployed for as carrier for the model drug crystals. Lysozyme again was used as a crystallizable protein and the effect of process- as well as formulation parameters of batch crystallization on crystal size were investigated using statistical design of experiments. Lysozyme crystal size depended on temperature and sodium chloride and poly(ethylenglycol) concentration of precipitant solution. Under optimized conditions, lysozyme crystals in a size range of approximately 0.3 to 10 µm were obtained. Furthermore, a solid-in-oil-in-water process for encapsulation of lysozyme crystals into SF was developed. Using this process, coating of protein crystals with another protein was achieved for the first time. Encapsulation resulted in a significant reduction of dissolution rate of lysozyme crystals, leading to prolonged release over up to 24 hours. / Immer mehr neu zugelassene Arzneimittel sind Proteine. Obwohl viele von ihnen in wässrigen Milieus sehr instabil sind, werden die meisten Proteine immer noch als Parenteralia formuliert. Kontrollierte Freisetzungssysteme sind selten, und das obwohl zahlreiche Proteine regelmäßig verabreicht werden müssen. Kapitel 1 befasst sich mit den aktuellen Fortschritten im Bereich der kontrollierten Darreichungsformen für Proteinpartikel. Das Hauptaugenmerk liegt klar auf den „batch“ kristallisierten Proteinen, aber auch allgemeine ‚amorphe‘ Proteinpartikel werden diskutiert. Das liegt daran, dass zum einen präzipitierte Proteinpartikel ebenfalls einige Vorteile der Proteinkristalle haben und zum anderen wurde in einigen Fällen der physikalische Zustand der Proteine nicht bestimmt oder es wurden zumindest semi-kristalline Proteinpartikel verwendet. In diesem Kapitel werden Kristallisations- und Präzipitationsmethoden sowie kontrollierte Freisetzungssysteme mit und ohne vorherige Einbettung in ein Polymersystem zusammengefasst und kritisch diskutiert.
Kapitel 2 stellt eine neue Methode der Proteinkristalleinbettung durch Electrospinning vor. Electrospinning von Proteinen hat sich aufgrund des häufigen Einsatzes von organischen Lösemitteln als schwierig heraus gestellt und führt häufig zum Entfalten oder Denaturieren des Proteins. Aufgrund höherer thermodynamischer Stabilität und verbesserter Kompatibilität mit organischen Lösemitteln haben sich Proteinkristalle hier als attraktive wenngleich bisher ziemlich unbeachtete Alternative heraus gestellt. In diesem Kapitel wird das das Electrospinning von Proteinkristallsuspensionen erforscht und grundlegende Bedingungen für diese neuartige Art der Proteinverkapselung etabliert. Poly-ε-caprolacton (PCL) eignet sich hervorragend für das Electrospinning und zeichnet sich durch matrixkontrollierte Freisetzung, einfache Handhabbarkeit sowie gute Biokompatibilität aus. PCL wurde als Matrix und Lysozym als Modelprotein eingesetzt. Mittels Kombination zweier Lysozymkristalldurchmesser, 0,7 oder 2,1 µm, und der Variation des PCL-Fadendurchmessers zwischen 1,6 und 10 µm konnte die Initialfreisetzung innerhalb der ersten 24 Stunden zwischen ca. 10 und 100 % modifiziert werden. Die Beladung der PCL Mikrofäden mit Lysozym zwischen 0,5 und 5 % konnte ohne Beeinträchtigung des Herstellungsprozesses erreicht werden. Hierdurch konnte die gesamt freigesetzte Menge an Lysozym variiert werden, während die relative freigesetzte Menge konstant blieb. Um weitere Modifikationen an der Freisetzungsrate vorzunehmen, wurden Poly(ethylen glycol) und Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) dem PCL beigemischt. Dadurch konnte unter optimierten Bedingungen eine Freisetzungsdauer von über 11 Wochen erreicht werden.
Kapitel 3 greift die Entdeckungen des zweiten Kapitels auf und nimmt weitere Modifikationen an den Fasermatten vor. Die mit Proteinkristallen beladenen Fasermatten wurden wieder durch Electrospinning hergestellt und bestehen aus PCL, PLGA und Polidocanol (PD). Die Zusammensetzung der Matrix wurde variiert und die Auswirkungen des PD-Gehalts in binären Mischung, sowie des PD- und PLGA-Gehalts in ternären Mischsystemen auf die Verarbeitbarkeit, Fadenmorphologie, Wassersorption, Quellung und Wirkstofffreisetzung untersucht. Binäre Fasermatten aus einer Mischung aus PCL/PD zeigten PD-abhängige Zunahme der Quellung von bis zu 30 % und eine Zunahme der Initialfreisetzung von bis 45 %. Dieser Anstiege werden einer Veränderung der Fasermorphologie zugeschrieben. Das Hinzufügen von freiem PD zum Freisetzungsmedium von reinen PCL Fasermatten führte zu einer Zunahme der Initialfreisetzung von ca. 2 % auf etwa 35 %. Durch den Einsatz von ternären Mischsystem, bestehend aus PCL/PD/PLGA, kam es zu einem signifikant erhöhten Matrixabbau gegenüber den PCL/PD Mischungen. Das führte wiederrum zu einem zweiphasigen Freisetzungsverhalten, das durch eine konstante Freisetzungsrate innerhalb von 9 Wochen, sowie eine anschließende langsamere, ebenfalls konstante Freisetzung über weitere 4 Wochen gekennzeichnet war. Aufgrund dieser Ergebnisse kann gesagt werden, dass die Proteinfreisetzung aus PCL Matrices durch das Hinzufügen von PD aufgrund von verbesserter Lysozymdesorption vom Polymer sowie PD-abhängiger Matrixquellung verbessert werden konnte.
Kapitel 4 bringt tiefere Erkenntnisse bezüglich der Lysozym Batchkristallisation und zeigt den Einfluss der Temperatur auf die verwendeten Fällungsreagenzien. Bis heute stellt die Kristallisation von Proteinen in einem pharmazeutisch sinnvollen Maßstab eine Herausforderung dar, wobei die Kristallgröße und die Reinheit wichtige und dennoch schwer kontrollierbare Parameter sind. Einige dieser Einflüsse werden hier näher beleuchtet und Kristallisationsmethoden sowie die erhaltenen Kristalle näher beschrieben.
Lysozym wurde erneut als kristallisierbares Protein eingesetzt und die Einflüsse der Prozess- sowie Formulierungsparameter der Batch-Kristallisation mit Hilfe von statistischen Experimentendesigns (Design of Experiment, DoE) untersucht. Die Kristallgröße wurde durch die Temperatur sowie die Natriumchlorid- und Poly(ethylenglycol)konzentration der Fällungslösung bestimmt. Unter kontrollierten Bedingungen konnten Kristallgrößen in einem Bereich zwischen ca. 0.3 bis 10 µm erreicht werden. Darüber hinaus wurde ein „solid-in-oil-in-water“ (Feststoff-in-Öl-in-Wasser) Verfahren entwickelt mit dem Lysozymkristalle in Seidenfibroin eingebettet werden konnten. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden erstmals Proteinkristalle mit einem anderen Protein überzogen. Diese Einbettung brachte eine signifikante Auflösungsverzögerung mit einer verlängerten Freisetzung über 24 Stunden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:12637 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Puhl, Sebastian |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_mit_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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