Apesar da rápida expansão das aplicações da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em química clínica, a análise de metabólitos de baixo peso molecular e alta polaridade em matrizes biológicas ainda permanece como um grande desafio analítico. Dentre os compostos de grande importância no diagnóstico de doenças metabólicas que ainda carecem de melhores alternativas bioanalíticas destacam-se os aminoácidos. O presente estudo descreve o desenvolvimento e a validação de um novo método para a quantificação de 24 aminoácidos em plasma explorando a cromatografia líquida acoplada a espectrômetros de massas em tandem. Foi construído um método de detecção baseado em SRM (múltiplas reações selecionadas) com duas transições de massas para cada um dos 24 aminoácidos e os 19 padrões internos marcados com isótopos estáveis. Foram avaliadas três estratégias de separação cromatográfica e o melhor desempenho foi obtido com fase reversa com octadecilsilano (C18) com pareamento iônico com o ácido perfluoropentanoico. O método cromatográfico final permitiu a separação dos 24 aminoácidos, com resolução completa dos isômeros: leucina, isoleucina e allo-isoleucina, em 11 minutos incluindo o tempo de re-estabilização da coluna cromatográfica. Os limites de quantificação variaram em 113 fmol a 6 pmol injetados na coluna cromatográfica. A imprecisão obtida nos níveis testados para todos os aminoácidos foi inferior a 14%. O método apresentou linearidade para os intervalos testados chegando a 1,5 mmol.L-1 para vários compostos. Os ensaios de arraste mostraram que os limites máximos obtidos na linearidade não geram nenhuma interferência subsequente. A exatidão do método foi avaliada com amostras provenientes do programa de referência interlaboratorial European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) e com o material de referência certificado do National Institute of Standards and Technology (NIST). Todos os analitos mostraram equivalência estatística com o método desenvolvido. / Despite the widespread use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry applications in clinical chemistry, the analysis of low molecular weight and high polar metabolites in biological matrices remains as a major analytical challenge. Notwithstanding the key role played by amino acids in the diagnosis of metabolic diseases, there is still need for improvements in bioanalytical process of these analytes. The present study describes the development and validation of a new method for quantification of 24 amino acids in plasma based on liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Detection and quantification were achieved building a selected reaction monitoring method two mass transitions for each 24 amino acids and 19 stable isotope internal standards. Three chromatographic strategies for separation were evaluated, and best performance was achieved using reversed-phase octadecylsilane with perfluropentanoic acid as ion pairing agent. The separation method allowed separation of 24 amino acids with full resolution for isomers leucine, isoleucine and alloisoleucine in 11 minutes, including column equilibration time. The limits of quantification ranged from 113 fmol to 6 pmol (on column injection). Imprecisions for all evaluated levels and amino acids were less than 14%. The method is linear in all clinical intervals and extending up to 1.5 mmol.L-1. Carryover evaluation demonstrated absence of interference in the following injection throughout the analytical interval. Method accuracy was evaluated analyzing reference samples from European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) and National Institute of Standards and Technology (NIST). Statistical equivalence was demonstrated for all analytes using the present method.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22122015-092807 |
| Date | 18 December 2015 |
| Creators | Salgueiro, Jessica Silva |
| Contributors | Carvalho, Valdemir Melechco |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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