A terapia fotodinâmica (PDT) é uma modalidade terapêutica utilizada para causar morte celular baseada no uso de fármacos fotossensibilizadores e aplicação de luz com comprimento de onda adequado. No processo fotodinâmico, a molécula do fotossensibilizador (FS) é excitada para o seu estado singleto como resultado da absorção da luz gerando estresse oxidativo em diversas estruturas celulares, dentre elas a mitocôndria. A geração do estresse oxidativo pode induzir a resposta de morte por via apoptótica. Esse estudo tem como objetivo avaliar o tipo de resposta de morte celular em formas promastigotas metacíclicas de Leishmania (L.) amazonensis submetidas à PDT utilizando o azul de metileno como FS. Para isso algumas condições como captação do FS pela célula, potência de irradiação (100 mW/ 250m W), concentração do FS (50, 100, 250 e 500 μM) e tempo de irradiação (60 s /300 s) foram testadas para compreender a resposta do parasito a esse desafio leishmanicida. Após essas etapas foi investigada a viabilidade das promastigotas por meio da atividade mitocondrial utilizando o MTT ((brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium). Em seguida, a exposição de fosfatidilserina, a permeabilidade de membrana e a alteração de potencial de membrana da mitocôndria foram avaliados para analisar a via de resposta de morte celular provocada pela ação fotodinâmica e as possíveis mudanças morfológicas e ultraestruturais que esse parasito pudesse apresentar. Os resultados obtidos pelos testes \"in vitro\" de viabilidade celular (MTT) das promastigotas demostra que a terapia consegue diminuir a atividade metabólica em até 80%, na condição de 50 μM - 100 mW/300s. Foi possível concluir que promastigotas de L.(L.) amazonensis sofrem dano celular provocado pelo estresse oxidativo. A morte celular desse parasito é possivelmente por via apoptótica. A análise por microscopia eletrônica de transmissão indica danos celulares como encolhimento celular, arredondamento, vacuolização do meio intracelular, perda de integridade do flagelo e migração da cromatina nuclear para a periferia da membrana do núcleo do parasito. / The photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality used to cause cell death based on the substances with photosensitizing properties and application of a light with suitable wavelength. In the photodynamic process, photosensitizer (PS) molecule is excited to its singlet state as a result of light absorption generating oxidative stress on many cellular structures, among them the mitochondria. The oxidative stress may induce cell death by apoptosis. Thus, this study aims to evaluate the type of cell death in promastigotes forms of Leishmania amazonensis following PDT using the methylene blue as PS. For that certain conditions as PS uptake, power irradiation, PS concentration and irradiation time were tested to investigate the response of the parasite to this leishmanicidal challenge. After these steps, it has been investigated the viability of the promastigotes, the cell death response pathway caused by photodynamic challenge and the possible morphological and ultrastructural changes that this parasite could present. The results obtained by the in vitro cell viability tests (MTT) of promastigotes indicate that the therapy can reduce metabolic activity by up to 80%, in the condition of 50 μM - 100 mW / 300s. It was concluded that L. amazonensis suffers cell damage caused by oxidative stress. The analysis by transmission electron microscopy indicated cell damage and cell shrinkage, rounding, vacuolization of the intracellular environment, scourge of integrity loss and migration of nuclear chromatin to the periphery of the membrane of the nucleus of the parasite.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13122017-103902 |
| Date | 27 November 2015 |
| Creators | Aureliano, Debora Picanço |
| Contributors | Lindoso, José Angelo Lauletta, Ribeiro, Martha Simões |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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