El objetivo de esta Tesis es el estudio de diferentes comportamientos celulares dinámicos en Escherichia coli y Bacillus subtilis. Es interesante comprender cómo estos organismos sencillos poseen mecanismos complejos para responder al entorno en el que se encuentran. Dicha respuesta está regulada por complicadas redes de regulación formadas por genes y proteínas, donde al igual que los instrumentistas de una orquesta, cada elemento de las redes genéticas debe tomar parte en armonía, en el momento justo y la cantidad adecuada para dar lugar a la respuesta celular apropiada.
La Parte I introduce aspectos básicos de la metodología utilizada y conceptos fundamentales para la comprensión de los resultados. El Capítulo 1 es una breve introducción a los circuitos de regulación genética y el uso de proteínas fluorescentes para el estudio in vivo y en células individuales de la dinámica de dichos circuitos. El Capítulo 2 describe los materiales y técnicas utilizadas, desde el cultivo y obtención de cepas bacterianas, los métodos para filmar dichas cepas con microscopía de fluorescencia temporalizada, al análisis de las imágenes. El Capítulo 3 describe las características básicas de los procesos biológicos de estudio. El Capítulo 4 describe ciertos aspectos de la dinámica celular como el comportamiento oscilatorio o excitable de algunos sistemas biológicos, y las herramientas matemáticas usadas para contrastar los datos experimentales.
La Parte II corresponde a los resultados. El Capítulo 5 describe los resultados del estudio del control del inicio de la replicación cromosómica en E. coli. Mediante una serie de perturbaciones en las proteínas que regulan este proceso, y mediante el análisis de las imágenes obtenidas por microscopía, se cuantificó el efecto ejercido sobre el inicio de replicación, comparando los resultados con una cepa control. El Capítulo 6 describe los resultados del estudio de la forma en que el circuito genético que regula la competencia en B. subtilis integra múltiples señales simultáneas. Se caracterizó experimentalmente y con un análisis de bifurcación del modelo matemático del circuito, la respuesta en células individuales e in vivo a señales químicas de diferente intensidad que controlan la expresión constitutiva de los genes que forman el circuito, y a la variación del número de copias de uno de estos genes. El Capítulo 7 describe los resultados del estudio del proceso de toma de decisión celular en B. subtilis, basado en la decisión de estas bacterias por optar entre los programas de diferenciación en competencia genética y esporulación, los cuales compiten entre sí en el tiempo. El análisis simultáneo y en células individuales de ambos programas permitió descubrir por qué las bacterias optan por uno u otro mediante un mecanismo de carrera molecular entre estos dos programas en competición. El Capítulo 8 describe los resultados del estudio de la adaptación celular al estrés mediante esporulación y la toma de decisión de una forma robusta en B. subtilis. Se analizó de forma cuantitativa la expresión de los genes implicados en la progresión hacia la formación de esporas y se desarrolló un modelo matemático poblacional para estudiar el efecto de la reversibilidad en el proceso de adaptación celular a cambios en los niveles de estrés.
La Parte III corresponde a las Conclusiones y la perspectiva futura para los resultados descritos en la Parte II.
Los resultados obtenidos contribuyen a la comprensión de determinados comportamientos en E. coli y B. subtilis. Estas bacterias, sencillas si se comparan con organismos superiores, ofrecen la posibilidad de estudiar mecanismos utilizados por sistemas más complejos, pero que para su estudio se requieren técnicas complicadas. El estudio en células individuales de la dinámica de redes de regulación mediante las técnicas utilizadas nos permite el análisis in vivo y en tiempo real de lo que sucede con dichas redes en el interior de las células respecto al exterior celular. / The aim of this Thesis is the study of different dynamic cellular behaviors in Escherichia coli and Bacillus subtilis. It is interesting to understand how these simple organisms have not so simple mechanisms to respond to their environment. This response is regulated by complex regulatory networks consisting of genes and proteins, where as instrumentalists in an orchestra, each element of the network should operates in harmony, at the right time and the right amount to give an appropriate cellular response.
Part I introduces basic aspects of the methodology and concepts for the understanding of the results presented in this Thesis. Chapter 1 provides a brief introduction to genetic regulatory circuits and the fluorescent proteins used for the study of the dynamics of such circuits in vivo and in individual cells. Chapter 2 describes the materials and techniques used, from growing and obtaining bacterial strains, to the methodology used for filming these strains by temporalized fluorescence microscopy, and to the analysis of the obtained images. Chapter 3 describes the main features of the dynamical biological processes studied in E. coli and B. subtilis. Chapter 4 refers to certain aspects of cellular dynamics such as oscillatory or excitable behavior of some biological systems, as well as the mathematical tools used to compare the data obtained experimentally.
Part II corresponds to the results. Chapter 5 describes the results of the study of the control of chromosome replication initiation in E. coli. We implemented a set of perturbations in the main proteins that regulate this process, and their effect on the initiation of replication, quantified by analyzing the images obtained by fluorescence microscopy, comparing the results with a control strain. Chapter 6 describes the results obtained from the study of how a genetic circuit in B. subtilis, namely the one regulating competence, integrates multiple simultaneous inputs. We characterized experimentally the response of individual cells in vivo to different chemical signals that control the strength of the constitutive expression of genes forming the circuit, in addition to the copy number variation of one of these genes. The results were compared with a bifurcation analysis of the mathematical model of the circuit. Chapter 7 describes the results obtained in a study of the decision making process of microorganism B. subtilis. Specifically, we studied the decision of these bacteria between two differentiation programs such as genetic competence and sporulation, which compete with each other in time. The simultaneous analysis in individual cells of both programs allowed us to uncover the way in which bacteria choose between these two competing programs, showing that the competition occurs through a molecular race. Finally, Chapter 8 describes the results obtained in the study of reversible progression towards an all-or-none switch in the sporulation of B. subtilis. We quantitatively analyzed the expression of genes involved in the progression towards spore formation and a population model was developed to study the effect of reversibility in the process of cellular adaptation to changes in stress levels.
Part III details the conclusions and a description of the possible future perspectives for each of the results described in Part II.
The results obtained contribute to the understanding of certain dynamic behaviors in the microorganisms E. coli and B. subtilis. These bacteria, although simple when compared with higher organisms, offer the possibility of studying mechanisms that are frequently utilized by more complex systems, which require more sophisticated analysis techniques. The study at the single cell level of network dynamics of gene regulation by the techniques used in this Thesis, allows the analysis in vivo and in real time of the underlying dynamic of such networks inside cells in response to the cell environment.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPC/oai:www.tdx.cat:10803/119738 |
| Date | 21 December 2012 |
| Creators | Espinar Calvo, María Lorena |
| Contributors | García Ojalvo, Jordi, Universitat Politècnica de Catalunya. Departament de Física Aplicada |
| Publisher | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Source Sets | Universitat Politècnica de Catalunya |
| Language | Spanish |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 222 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/ |
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