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Previous issue date: 2010-10-27 / O enfoque do nosso trabalho foi estudar a participação de neutrófilos na infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis utilizando-se linhagens de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C3H/HePAs). Inicialmente, comparamos a evolução das lesões causadas pela L. (L.) amazonensis nas linhagens BALB/c e C3H/HePas, demonstrando-se que os camundongos BALB/c apresentam aumento gradativo das lesões, enquanto que a doença não evolui na linhagem C3H/HePas. A análise histológica das lesões dos camundongos BALB/c mostrou grande infiltração de macrófagos parasitados, com vacúolos repletos de amastigotas da L. (L.) amazonensis, poucos linfócitos, poucos neutrófilos e hiperplasia de células epiteliais. Por outro lado, as lesões dos camundongos C3H/HePas mostraram características de reação inflamatória intensa, com o início de processo do tipo granulomatoso, onde se observam células epitelióides, alguns linfócitos e raros amastigotas da L. (L.) amazonensis. A cinética da infecção de macrófagos de medula óssea in vitro ativados ou não com IFN-! mostrou o aumento progressivo da carga parasitária nas culturas de ambas as linhagens de camundongos. Esses resultados demonstraram que a resistência dos camundongos C3H/HePas à L. (L.) amazonensis não se deve a um mecanismo intrínseco de destruição pelos macrófagos e tampouco pode ser atribuída à ativação dos macrófagos por IFN-!. Acentuada destruição da L. (L.) amazonensis foi observada nas coculturas de macrófagos infectados e neutrófilos. Demonstrou-se que a atividade leishmanicida nas coculturas não depende do perfil de resistência dos animais, pois não houve diferença na destruição dos parasitas entre os camundongos BALB/c e C3H/HePas. Além disso, essa destruição não depende do contato entre os macrófagos infectados e os neutrófilos, estando relacionada à secreção de fatores solúveis. Enquanto que a análise das citocinas nas coculturas mostrou que a proteína quimiotáctil de monócitos (MCP-1) predomina nos sobrenadantes dos macrófagos 24 horas após a infecção com a L. (L.) amazonensis, a detecção de IL-6 e TNF-! indicou o ambiente inflamatório nas coculturas. Corroborando esses resultados, a inibição significante da atividade leishmanicida nas coculturas em presença do anticorpo anti-TNF-! mostrou o envolvimento dessa citocina na destruição dos parasitas. Por outro lado, a atividade leishmanicida das coculturas foi independente da ação do óxido nítrico, ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, indicando que a destruição da L. (L.) amazonensis não está correlacionada à ativação clássica do macrófago pelo TNF-!. A participação da elastase do neutrófilo (NE) e do fator ativador de plaquetas (PAF) na atividade leishmanicida das coculturas também foi demonstrada. A análise das citocinas nas lesões das duas linhagens estudadas mostrou a secreção do TGF-" no início da infecção nos camundongos BALB/c, enquanto que o TNF-! predominou na linhagem C3H/HePas. Esses achados reforçam os resultados iniciais que mostraram a persistência de um processo inflamatório nas lesões dos camundongos C3H/HePas, com infiltração de neutrófilos, resultando na destruição da L. (L.) amazonensis nesses animais. A depleção de neutrófilos com anti Gr-1 mostrou a diminuição significante dessas células nos animais tratados, porém sem alteração no curso da infecção em ambas as linhagens. Por outro lado, a ativação de neutrófilos nos camundongos BALB/c tratados com o KC retardou a evolução das lesões nesses animais. Os dados desse trabalho demonstram que a interação dos neutrófilos com os macrófagos infectados exerce um eficiente efeito leishmanicida sobre a L. (L.) amazonensis. Pode-se ressaltar ainda que esse trabalho abriu perspectivas de explorar o papel dos neutrófilos na imunidade inata da infecção por esse parasita, constituindo a linhagem C3H/HePas uma ferramenta muito útil para a continuidade desse estudo. / The present study focused on the role of neutrophils in Leishmania (Leishmania) amazonensis infection by use of susceptible (BALB/c) and resistant (C3H/HePas) mouse strains. Comparison of the outcome of L. (L.) amazonensis infection between the two mouse strains demonstrated a gradual increase of foot lesions in BALB/c mice, whereas the disease did not develop in the C3H/HePas strain. Histopathological analysis of foot lesions showed a predominance of macrophages harboring a high number of L. (L.) amazonensis amastigotes, few lymphocytes and neutrophils and hyperplasia of epithelial cells in BALB/c mice. In contrast, an intense inflammatory reaction with a large infiltrate of neutrophils, an initial granulomatous process exhibiting epithelioid cells and lymphocytes and rare L. (L.) amazonensis amastigotes were observed in C3H/HePas mice. Kinetics of in vitro infection of bone marrow macrophages was carried out in the presence or in the absence of IFN-! and showed increased parasite burden in the cultures from both mouse strains. These results demonstrated that the resistance of C3H/HePas mice to L. (L.) amazonensis could not be attributed either to an intrinsic mechanism of L. (L.) amazonensis macrophage destruction or to the macrophage activation by IFN-!. An effective destruction of L. (L.) amazonensis amastigotes was observed in cocultures of macrophages with inflammatory neutrophils in vitro. The leishmanicidal activity of the cocultures did not depend on the animal resistance profile since the parasite destruction was similar when cells were obtained from BALB/c or C3H/HePas mice. Furthermore, amastigote killing did not require contact between infected macrophages and neutrophils, indicating that the parasite destruction is mediated by soluble factors. The cytokine analysis showed that the MCP-1 protein was detected in the supernatants of macrophages 24 hours after infection with L. (L.) amazonensis, whereas secretion of IL-6 and TNF-! indicated a predominance of an inflammatory environment in the cocultures. These results were corroborated by the significant inhibition of the leishmanicidal activity of the cocultures in the presence of anti-TNF- !. However, the L. (L.) amazonensis destruction did not depend on generation of nitric oxide, superoxide or oxygen peroxide, indicating that parasite clearance did not involve the classical pathway of macrophage activation by TNF-!. The implication of neutrophil elastase (NE) and platelet activating factor (PAF) in parasite destruction in the cocultures was also demonstrated. The cytokine analysis in the foot lesions of BALB/c and C3H/HePas strains infected with L. (L.) amazonensis showed an early secretion of TGF-! in BALB/c mice whereas TNF-" predominated in the C3H/HePas strain. These results support our initial observations on the persistence of an inflammatory environment in foot lesions of C3H/HePas mice with infiltration of neutrophils resulting in L. (L.) amazonensis destruction. Depletion with anti Gr-1 in BALB/c and C3H/HePas mice led to a significant decrease of neutrophils in both mouse strains but did not change the course of L. (L.) amazonensis infection. On the other hand, the neutrophil activation with KC delayed the development of foot lesions in BALB/c mice. In conclusion, our data demonstrated that interaction between neutrophils and L. (L.) amazonensis-infected macrophages induces an effective parasite destruction. It is still important to emphasize that our findings opened perspectives to explore the role of innate immunity in L. (L.) amazonensis infection and the C3H/HePas strain constitutes an useful tool for the extension of this study. / TEDE
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9009 |
| Date | 27 October 2010 |
| Creators | Carmo, Érico Vinícius de Souza [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Barbiéri, Clara Lúcia [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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