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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA), em cães, costuma estar associada à resposta humoral baixa ou mesmo negativa, o que inviabiliza os métodos sorológicos convencionais, como ferramenta única no diagnóstico. A busca por métodos mais sensíveis no diagnóstico tem avançado muito com o emprego de métodos moleculares, e a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem fornecido inúmeros resultados fundamentais nos estudos epidemiológicos. Métodos convencionais de diagnóstico parasitológico, não têm sido capazes de detectar a presença do parasito em outros sítios anatômicos diferentes da lesão cutânea, em cães naturalmente infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. Diante dos questionamentos sobre o papel do cão doméstico no ciclo de transmissão da LTA e sobre o valor de métodos diagnósticos aplicados na rotina, principalmente em áreas de sobreposição da forma tegumentar e visceral, faz-se necessário a avaliação desses animais sob diversos aspectos. O presente estudo teve como objetivo empregar a PCR específica associada à hibridização molecular e a técnica da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) visando detectar a presença de DNA parasitário e investigar a variabilidade genética de populações parasitárias presentes em diferentes tecidos de cães naturalmente infectados por L. (V.) braziliensis. Os animais foram selecionados entre os cães sororeatores para Leishmania procedentes de cidades do estado do Rio de Janeiro e encaminhados para eutanásia ao Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz. Durante a necropsia, foram obtidas amostras de lesão cutânea, pele íntegra (região escapular e abdominal), baço, fígado e linfonodos (poplíteo e cervical)
Os fragmentos teciduais foram submetidos ao isolamento parasitário e à extração de DNA. A detecção de DNA de L. (V.) braziliensis foi realizada através da amplificação, pela PCR específica, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam a região variável dos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) de espécies do subgênero Viannia. Os produtos positivos na PCR foram reamplificados, pela técnica de LSSP-PCR, utilizando-se um único iniciador do par específico, em condições de baixa temperatura de anelamento. O polimorfismo genético da região variável dos minicírculos foi avaliado através de métodos de análise numérica. Nove animais foram estudados. O isolamento parasitário foi possível somente nos fragmentos de lesão cultivados em todos os animais, no entanto com a aplicação das técnicas moleculares mencionadas, foi possível detectar DNA de L. (V.) braziliensis em pele íntegra de cães naturalmente infectados tendo sido, ao nosso conhecimento, o primeiro relato no Brasil. Foi também possível observar o tropismo diferenciado e a capacidade de disseminação parasitária para outros sítios anatômicos, além da lesão cutânea, no cão naturalmente infectado. Nossos resultados contribuirão para o diagnóstico e a epidemiologia da LTA canina no Rio de Janeiro fornecendo elementos na discussão da importância do papel do cão no ciclo de transmissão e subsídios para os programas de controle / In dogs, A
merican tegumentary leishmaniasis (ATL) is usually associated to a low humoral response
or even to negative results which turns not unfeasible the conventional serological methods. The
search for more sensitive methods in the diagno
sis has progressed by the use of molecular methods
and, the technique of polymerase chain reaction (PCR) has been furnishing several results which can
be consider of fundamental importance in epidemiological studies. Conventional methods of
parasitologic
al diagnosis have failed to detect the presence of the parasite anatomic sites others than
the cutaneous lesion, in dogs naturally infected by
Leishmania (Viannia) braziliensis.
Regarding the
questions on the rule of domestic dogs in the transmission cycle
of ATL and, on the applicability of
diagnostic methods mainly in areas where both visceral and tegumentary disease are found, the
evaluation of these animals under different aspects is needed. The objective of this project is to apply
specific PCR assays
associated to molecular hybridization and the technique of Low
-
Stringency
Specific
-
Single Primer
–
PCR (LSSP
-
PCR) in order to detect the presence of parasite DNA and
evaluate the gen
etic variability of parasite
populations found in different tissues of dog
s naturally
infected by
Leishmania (V.) braziliensis
.
The animals were selected among dogs which were
Leishmania
seropositive
from cities of Rio de Janeiro state and
referred for euthanasia to the
Derm
o
zoo laboratory (
Laboratório de Pesquisa Clínica em Der
matozoonoses em Animais Domésticos
do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz
)
.
Samples were obtained
from cutaneous lesions, health skin, spleen, liver and lymph nodes (popliteal and cervical). Tissue
fragments were submitted
to parasite isolation and to DNA extractions. The detection of
L. (V.)
braziliensis
was performed by specific PCR assays, using a par of primers that amplify the variable
region of the minicircles of the kinetoplast DNA (kDNA) from species of the
Viannia
subgenus. The
positive PCR products were re
-
amplified by the technique of LSSP
-
PCR using a unique primer of the
specific par, in low stringency conditions. The genetic polymorphism of the variable region of kDNA
minicircles were investigated through numeri
cal analysis methods.
Nine animals were studied. The
parasitic isolation was only possible in fragments cultured in lesion of all animals. U
sing such
methods, it was possible to detect
L. (V.) braziliensis
DNA in heath skin of dogs naturally infected. To
o
ur knowledge this is the first report in Brazil. It was also possible to observe the differentiate tropism
and the capacity of parasite dissemination to other anatomic sites beyond the cutaneous lesion. Our
results will contribute, at the same time, to the
diagnosis and the epidemiology of canine ATL in Rio
de Janeiro, providing basis for the discussion of the rule of the dog in the transmission cycle of ATL
and, also providing subsidies to the control programs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/14279 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Oliveira, Guilherme Marx de |
| Contributors | Figueiredo, Fabiano Borges, Neufeld, Paulo Murillo, Oliveira, Fernanda Santos, Pacheco, Raquel da Silva, Madeira, Maria de Fátima |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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