La leishmaniose est une maladie tropicale négligée à transmission vectorielle qui est endémique dans 98 pays dont les plus pauvres. Vingt espèces de Leishmania sont capables d’établir une infection intracellulaire au sein des macrophages humains, provoquant différentes manifestations cliniques. Le développement d'un vaccin contre les leishmanioses est étayé par des preuves d'immunité naturelle contre l'infection, induite par une réponse à médiation cellulaire de type Th1 dominante associée à la production d'IFN-γ, d'IL-2 et de TNF-α par des cellules T polyfonctionnelles TCD4+ et TCD8+, conduisant à l'activation classique des macrophages entrainant la destruction des parasites. Induire une protection robuste et durable et déterminer les épitopes immunodominants responsables de la protection naturelle représente un véritable défi.Les protéines sécrétées sont des facteurs de virulence jouant un rôle important dans le cycle de vie des leishmanies et sont capables d’induire une protection durable chez le chien, un bon modèle pour l’infection humaine. Notre objectif est de développer, à partir du sécrétome de Leishmania, un vaccin de seconde génération reproductible et facile à produire à bas prix dans les zones d’endémie, avec des rendements de production rendant possible son utilisation à grande échelle.Les sécrétomes des six espèces les plus pathogènes de leishmanie (plus L. tarentolae) ont été analysés et comparées par spectrométrie de masse. Les antigènes candidats ont été recherchés dans l'ensemble des données disponibles (analyses protéomiques, littérature…). 52 antigènes candidats vaccin ont ainsi été sélectionnés, dont 28 avaient déjà été décrits et 24 sont nouveaux et découverts grâce à une approche de vaccinologie réverse.Une analyse de la prédiction de liaison des épitopes in silico HLA-I et –II a été réalisée sur tous les antigènes candidats vaccin, prenant ainsi en compte le polymorphisme HLA de la population mondiale. Pour sélectionner les meilleurs épitopes parmi des milliers d’épitopes potentiels, un script R automatisé a été développé en interne, selon des critères rationnels stricts. Ainsi, 50 épitopes de classe I et 24 épitopes de classe II ont été sélectionnés et synthétisés sous forme de peptides individuels. Des essais de toxicité in vitro ont montré l’absence de toxicité cellulaire de ces peptides.Les individus guéris par chimiothérapie généralement développent des réponses immunitaires protectrices à Leishmania. Des tests de stimulation des PBMC ont donc été réalisés avec des échantillons biologiques provenant de donneurs guéris de Tunisie et la production d'IFN-γ a été évaluée par ELISpot. De plus, il était important d'inclure dans l'étape de validation expérimentale des peptides des échantillons provenant d’individus naïfs, population cible à vacciner avec un vaccin prophylactique. Les résultats montrent que des peptides spécifiques de Leishmania induisent avec succès la production d'IFN-γ par les PBMC totaux provenant de donneurs guéris et par les lymphocytes T spécifiques amplifiés à partir du répertoire naïf.Globalement, la validation expérimentale des peptides réalisée exclusivement sur des échantillons humains nous fournira une base préclinique très solide pour développer un vaccin efficace capable de protéger les populations touchées par ces maladies. Elle constituera un moyen sûr et rentable de mieux sélectionner les candidats retenus pour le vaccin et d'éliminer ceux qui présentent un risque d'échec élevé au tout début du processus de développement du vaccin.Grâce à la combinaison de l'analyse protéomique et d'outils in silico, des candidats peptidiques prometteurs ont été rapidement identifiés pour le développement d'un vaccin. Le « pipeline » de développement préclinique du vaccin proposé fournit une sélection rapide de peptides immunogènes, offrant une approche puissante pour accélérer le déploiement d'un vaccin pan-spécifique efficace contre les leishmanioses. / Leishmaniasis is a vector-borne neglected tropical disease endemic to 98 countries worldwide. Twenty Leishmania species are capable of establishing intracellular infection within human macrophages, causing different clinical presentations. Vaccine development against leishmaniases is supported by evidence of natural immunity against infection, mediated by a dominant cellular Th1 response and production of IFN-γ, IL-2 and TNF-α by polyfunctional TCD4+ and TCD8+ cells, ultimately leading to macrophage activation and parasite killing.Excreted-secreted proteins are important virulence factors present throughout Leishmania life stages and are able to induce durable protection in dogs, a good model for human infection. We aim to develop a second generation vaccine from the Leishmania secretome, with the potential for large scale dissemination in a cost-effective, reproducible approach.The secretome of six main pathogenic species (plus L. tarentolae) was analysed by Mass-Spectrometry and conserved candidate antigens were searched in the complete dataset. A total of 52 vaccine antigen candidates were selected, including 28 previously described vaccine candidates, and an additional 24 new candidates discovered through a reverse vaccinology approach.In silico HLA-I and –II epitope binding prediction analysis was performed on all selected vaccine antigens, with world coverage regarding HLA restriction. To select the best epitopes, an automated R script was developed in-house, according to strict rational criteria. From thousands of potential epitopes, the automated script, in combination with optimal IC50, homology to host and solubility properties, allowed us to select 50 class I and 24 class II epitopes, synthesized as individual peptides. In vitro toxicity assays showed these selected peptides are non-toxic to cells.The peptides’ immunogenicity was evaluated using immunoscreening assays with immune cells from human donors, allowing for the validation of in silico epitope predictions and selection, and the assessment of the peptide’s immunogenicity and prophylactic potential. Healed individuals, which had active infection and received treatment, possess Leishmania-specific memory responses and are resistant to reinfection, being considered the gold standard of protective immunity. On the other hand, the naive population is extremely important to include in the experimental validation step since it is the target population to vaccinate with a prophylactic vaccine. Importantly, a minimum specific T-cell precursor frequency is needed to induce long-lasting memory protective responses. Furthermore, there is also a positive correlation between immunodominant epitopes and a high frequency of specific T-cell precursors. Peptides able to induce Th1 and/or cytotoxic immune responses in both background are promising candidates for a vaccine formulation. Altogether,experimental validation exclusively in human samples will provide us a very strong base for a vaccine formulation and allow to accelerate translation to the field.Results show Leishmania-specific peptides successfully induce IFN-γ production by total PBMC from healed donors, and by specific T cells amplified from the naïve repertoire. Preliminary evidence exists for peptides which are immunogenic in both immune backgrounds (eight HLA-class I 9-mer peptides and five class II 15-mer peptides) which are, for now, the most promising candidates to advance for the multi-epitope peptide design.Through the combination of proteomic analysis and in silico tools, promising peptide candidates were swiftly identified and the secretome was further established as an optimal starting point for vaccine development. The proposed vaccine preclinical development pipeline delivered a rapid selection of immunogenic peptides, providing a powerful approach to fast-track the deployment of an effective pan-specific vaccine against Leishmaniases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2019MONTT013 |
| Date | 26 June 2019 |
| Creators | Da Silva Pissarra, Joana |
| Contributors | Montpellier, Lemesre, Jean-Loup |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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