Les protéines receptor-interacting protein kinase 1 (RIP1) et RIP3 ont été identifiées comme intervenant dans la régulation de la mort cellulaire apoptotique ou nécroptotique mais également dans la survie cellulaire. Ces deux protéines possèdent un domaine sérine/thréonine kinase, un domaine d'interaction spécifique RHIM (RIP homotypic interacting motif) et diffèrent dans leur domaine C-terminal car seule RIP1 possède un domaine de mort. Ces protéines font partie d'un ensemble de protéines régulatrices nommé ripoptosome. Des études ont montré une altération du ripoptosome dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) et les leucémies aigües lymphoïdes (LAL). Nous nous sommes intéressés aux leucémies aigües myéloïdes (LAM). L'analyse de l'expression des protéines RIP1 et RIP3 a été réalisée dans des blastes triées CD34+ de patients atteints de LAM ou dans des cellules CD34+ de donneurs sains en Q-RT-PCR. Les premières analyses montrent que RIP3 est significativement sous-exprimée chez les patients atteints de LAM en comparaison avec les cellules CD34+ issues de donneurs sains. Aucune différence n'a été mise en évidence pour l'expression de RIP1 dans les deux types de cellules CD34+. Afin de comprendre l'implication de l'extinction de RIP3 dans les LAM, nous avons étudié sa réexpression dans une lignée cellulaire leucémique murine (DA1-3b) où RIP3 n'est pas exprimée par métylation de son promoteur, au moyen d'un système d'expression conditionnelle (LacSwith II, IPTG). Après 10h d'induction de l'expression, on constate que la protéine RIP3 sauvage (RIP3-WT) induit une apoptose dans les cellules DA1-3b. Afin de déterminer l'implication des domaines de RIP3, nous avons utilisé une protéine mutante kinase Dead (RIP3-KD, activité kinase abolie) et une protéine mutante dans la séquence d'interaction spécifique avec RIP1 (RIP3-RHIM). L'analyse de la mortalité cellulaire en cytométrie en flux et en microscopie électronique montre que les protéines RIP3-WT et -KD induisent toutes les deux la mort apoptotique des cellules DA1-3b respectivement de 15% et de 50% après 10h d'expression. On constate donc que la protéine RIP3-KD induit une mort plus importante et plus précoce que la protéine sauvage. La protéine RIP3 mutée dans son domaine RHIM ne peut plus induire de mort cellulaire. Il semble donc que le domaine kinase de RIP3 jouerait un rôle régulateur dans la mort cellulaire induite par RIP3. L'utilisation du modèle de leucémie murine DA1-3b a permis de réaliser un étude in vivo de l'expression conditionnelle de RIP3-WT et -KD. Seule l'expression de RIP3-KD est capable de prolonger significativement la survie des souris.De plus, il a été démontré que RIP3 pouvait également induire la nécroptose dans les cellules lorsque l'apoptose ne peut aboutir, notament lorsque les caspases sont inhibées à l'aide d'un inhibiteur de pan-caspases le Z-VAD-FMK. Le traitement des cellules exprimant RIP3-WT par 50µM de Z-VAD-FMK induit une plus forte mortalité (45%) des cellules tandis que dans les cellules exprimant RIP3-KD, l'inhibiteur des caspases inhibe complètement le processus apoptotique et permet la survie des cellules (10%). Une étude en microscopie électronique a permis de déterminer que la présence de Z-VAD-FMK induit un switch de l'apoptose vers la nécroptose. Il semble donc que le domaine de kinase possède un rôle important dans la signalisation de la nécroptose car la protéine RIP3-KD n'est plus capable d'initier le switch entre l'apoptose et la nécroptose. Quelques données préliminaires semblent indiquer que les calpaïnes ainsi que la caspase 12 pourraient également être impliquées dans la balance apoptose/nécroptose. [...]
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-01018661 |
| Date | 28 November 2013 |
| Creators | Nugues, Anne-Lucie |
| Publisher | Université du Droit et de la Santé - Lille II |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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